Raltegravir

Pour les essais quantitatifs de transfert de brin, le substrat d'ADN donneur est formé par recuit d'oligonucléotides de qualité HPLC 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA et 5′-ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC. Les réactions (40 μL) contiennent 0,75 μM d'IN PFV, 0,75 μM d'ADN donneur, 4 nM (300 ng) d'ADN cible pGEM9-Zf(−) superenroulé, 125 mM de NaCl, 5 mM de MgSO₄, 4 μM de ZnCl₂, 10 mM de DTT, 0,8 % (vol/vol) de DMSO et 25 mM de BisTris propane–HCl, pH 7,45. Raltegravir est ajouté aux concentrations indiquées. Les réactions sont initiées par l'ajout de 2 μL d'IN PFV diluée dans 150 mM de NaCl, 2 mM de DTT et 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, et arrêtées après 1 heure à 37 °C par l'ajout de 25 mM d'EDTA et 0,5 % (p/v) de SDS. Les produits de réaction, déprotéinisés par digestion avec 20 μg de protéinase K pendant 30 minutes à 37 °C suivie d'une précipitation à l'éthanol, sont séparés dans des gels d'agarose à 1,5 % et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Les produits d'intégration sont quantifiés par PCR quantitative en temps réel, en utilisant Platinum SYBR Green qPCR SuperMix et trois amorces : 5′-CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5′-TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC et 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGT. Les réactions de PCR (20 μL) contenaient 0,5 μM de chaque amorce et 1 μL de produit de réaction d'intégration dilué. Après une étape de dénaturation de 5 min à 95 °C, 35 cycles sont effectués dans un instrument de PCR CFX96, en utilisant 10 secondes de dénaturation à 95 °C, 30 secondes d'hybridation à 56 °C et 1 minute d'extension à 68 °C. Les courbes standard sont générées en utilisant des dilutions en série de la réaction d'IN PFV WT en l'absence de ce composé.

Human MT-4 cells

0.0001-1 μM

5 days

Human MT-4 cells are infected for 2 hours with the SIVmac251, HIV-1 (IIIB) and HIV-2 (CDC 77618) stocks at a multiplicity of infection of, approximately, 0.1. Cells are then washed three times in phosphate buffered saline, and suspended at 5 × 10⁵/mL in fresh culture medium (to primary cells 50 units/mL of IL-2 are added) in 96-well plates, in the presence or absence of a range of triplicate raltegravir concentrations (0.0001 μM -1 μM). Untreated infected and mock-infected controls are prepared too, in order to allow comparison of the data derived from the different treatments. Viral cytopathogeniciy in MT-4 cells is quantitated by the methyl tetrazolium (MTT) method (MT-4/MTT assay) when extensive cell death in control virus-infected cell cultures is detectable microscopically as lack of capacity to re-cluster. The capability of MT-4 cells to form clusters after infection. Briefly, clusters are disrupted by pipetting; and, after 2 hours of incubation at 37 °C, the formation of new clusters is assessed by light microscopy (100 × magnification). Cell culture supernatants are collected for HIV-1 p24 and HIV-2/SIVmac251 p27 core antigen measurement by ELISA. In CEMx174-infected cell cultures, which show a propensity to form syncytia induced by the virus envelope glycoproteins, syncytia are counted, in blinded fashion, by light microscopy for each well at 5 days following infection.

Indian Rhesus macaques

50 mg/kg or 100 mg/kg

Oral administration