BX-912 inhibitor de PDK

BX912 empêche ChcK1, PKA, c-kit et KDR avec des IC50 de 0,83, 0,11, 0,85 et 0,41 μM, respectivement. BX912 bloque la signalisation PDK1/Akt dans les cellules tumorales et supprime la croissance dépendante de l'ancrage d'une variété de lignées cellulaires tumorales (telles que les cellules PC-3) en culture ou induit l'apoptose. Un certain nombre de lignées cellulaires cancéreuses (telles que le cancer du sein MDA-468) présentant une activité Akt élevée sont plus de 30 fois plus sensibles à l'inhibition de la croissance par l'inhibiteur de PDK1 BX912 dans la gélose molle que sur le plastique de culture tissulaire, conformément à la fonction de survie cellulaire de la voie de signalisation PDK1/Akt, qui est particulièrement importante pour les cellules non attachées. BX912 bloque puissamment l'activité enzymatique de PDK1 dans un format de dosage de kinase direct, bien que BX912 échoue à bloquer l'activité AKT2 préactivée (IC50 > 10 μM). Par conséquent, BX-912 est un inhibiteur direct de PDK1. BX912 est un inhibiteur compétitif de l'activité de PDK1 par rapport à son substrat, l'ATP, suggérant que BX912 se lie à la poche de liaison de l'ATP de PDK1. Le squelette aminopyrimidine de BX912 adopte une orientation similaire dans le site actif de PDK1. BX912 favorise une augmentation prononcée de la population de cellules MDA-468 avec un contenu en ADN 4 N, indiquant un blocage à la phase G2/M du cycle cellulaire. BX912 inhibe également puissamment la croissance des cellules HCT-116 dans la gélose molle, montrant un effet inhibiteur de 96 % à une dose de 1 μM. BX912 inhibe puissamment la croissance des cellules PC-3 dans la gélose molle, affichant une IC50 de 0,32 μM. [1]

Dosages de kinases

PDK1 est évaluée dans un essai de kinase direct et un format d'essai couplé mesurant l'activation de AKT2 médiée par PDK1 et PtdIns-3,4-P2. Pour l'essai couplé, le mélange réactionnel final (60 μL) contenait : 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL d'albumine de sérum bovin, 18 mM de β-glycérol phosphate, 0,7 mM de dithiothréitol, 3 mM d'EGTA, 10 mM de MgOAc, 7,5 μM d'ATP, 0,2 μCi de [γ- ³³P]ATP, 7,5 μM de substrat peptidique biotinylé (biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL de vésicules de phospholipides contenant du PtdIns-3,4-P2, 60 pg de PDK1 humaine recombinante purifiée et 172 ng d'AKT2 humaine recombinante purifiée. Après incubation pendant 2 heures à température ambiante, le peptide marqué à la biotine est capturé à partir de 10 μL du mélange réactionnel sur des billes SPA enrobées de streptavidine, et la formation du produit est mesurée par scintillation de proximité dans un compteur Wallac MicroBeta. Le produit formé est proportionnel au temps d'incubation et à la quantité de PDK1 et d'AKT2 inactive ajoutée. La PDK1 est ajoutée à des niveaux sous-optimaux afin que l'essai puisse détecter de manière sensible les inhibiteurs de l'activation d'AKT2 ainsi que l'inhibiteur direct BX-912 de PDK1 ou d'AKT2. Pour mesurer directement l'activité de PDK1, le mélange réactionnel final (60 μL) contenait 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM d'EGTA, 0,1 mM d'EDTA, 0,1 % de β-mercaptoéthanol, 1 mg/mL d'albumine de sérum bovin, 10 mM de MgOAc, 10 μM d'ATP, 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7,5 μM de peptide substrat (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) et 60 ng de PDK1 humaine recombinante purifiée. Après 4 heures à température ambiante, 25 mM d'EDTA sont ajoutés et une partie du mélange réactionnel est déposée sur du papier phosphocellulosique P81. Le papier filtre est lavé trois fois avec de l'acide phosphorique à 0,75 % et une fois avec de l'acétone. Après séchage, le peptide marqué lié au filtre est quantifié à l'aide d'un phosphorimager.