Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl Inhibiteur

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) shows potent inhibitory activities against purified native Abl1 in unphosphorylated (u-Abl1^native) and phosphorylated (p-Abl1^native) forms, unphosphorylated and phosphorylated gatekeeper mutant Abl1^T315I, and the activation loop mutant Abl1^H396P in a non-ATP-competitive manner with IC50 values of 0.8 nM, 2 nM, 1.4 nM, 5 nM, and 4 nM, respectively. Moreover, it also inhibits the Src family kinases Src, LYN, FGR, and HCK, and the receptor TKs KDR, FLT3, and TIE2 with IC50 values of 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM and 6 nM, respectively. [1] This compound shows anti-proliferative activities against Ba/F3 cells expressing native or mutant Bcr-Abl1 with IC50 ranging from 2 nM to 150 nM. In addition, it also inhibits proliferation of the Ph⁺ cell line K562 (IC50 5.5 nM), and induces apoptosis in both Bcr-Abl1-expressing Ba/F3 and K562 cells potently. [1] A recent study shows that it exhibits selectivity for growth inhibition of Bcr-Abl-positive cells by its marked inhibition of CML cell lines compared to non-CML leukemia lines. [2]

Essai des isoformes de la kinase Abl1 et détermination de la puissance de l'inhibiteur

L'activité de u-Abl1native est déterminée en suivant la production d'ADP à partir de la réaction de la kinase par couplage avec le système pyruvate kinase/lactate déshydrogénase. Dans cet essai, l'oxydation du NADH (mesurée comme une diminution de A340nm) est surveillée en continu par spectrophotométrie. Le mélange réactionnel final (100 μL, dans une plaque Corning à 384 puits) est préparé comme suit : Un mélange de composants d'essai couplé Abl1 kinase est préparé contenant de l'u-Abl1 kinase (1 nM), de l'Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), du MgCl₂ (9 mM), de la pyruvate kinase (~ 4 unités), de la lactate déshydrogénase (~ 0,7 unités), du phosphoénol pyruvate (1 mM) et du NADH (0,28 mM) dans 90 mM Tris contenant 0,1 % d'octyl-glucoside et 1 % de DMSO, pH 7,5. Séparément, un mélange d'inhibiteur est préparé contenant du Rebastinib (DCC-2036) dilué en série 3 fois dans du DMSO, puis dilué dans un tampon composé de 180 mM Tris, pH 7,5, contenant du MgCl₂ (18 mM) et 0,2 % d'octyl-glucoside. Cinquante μL du mélange d'inhibiteur sont mélangés avec 50 μL du mélange de composants d'essai couplé Abl1 kinase ci-dessus, qui est ensuite incubé à 30 °C pendant 2 heures avant que 2 μL d'ATP 25 mM (500 μM, final) ne soient ajoutés pour démarrer la réaction. La réaction est enregistrée toutes les 2 minutes pendant 2,5 heures à 30 °C sur un lecteur de plaques Polarstar Optima ou Synergy2. Le taux de réaction (pente) est calculé en utilisant la période de 1 à 2 heures avec le logiciel du lecteur. Le pourcentage d'inhibition est obtenu par comparaison du taux de réaction avec celui d'un contrôle DMSO. Les valeurs d'IC50 sont calculées à partir d'une série de pourcentages d'inhibition déterminés à différentes concentrations d'inhibiteur à l'aide de GraphPad Prism. L'essai kinase pour Abl1T315I, p-Abl1native ou Abl1H396P est réalisé de la même manière que ci-dessus, sauf que 2,2 nM d'Abl1T315I, 1 nM de p-Abl1 native ou 1,3 nM d'Abl1H396P sont utilisés. Le format d'essai ci-dessus est également utilisé pour les kinases autres que Abl1 à l'exception de TIE2, pour lequel un format de polarisation de fluorescence/Transcreener est utilisé. Les conditions d'essai sont les mêmes que celles décrites ci-dessus, sauf que le PolyE4Y (1 mg/mL final) est utilisé comme substrat et qu'une préincubation d'une heure est utilisée.

In a mouse allograft model bearing Ba/F3-Bcr-Abl1T315I leukemia cells, treatment with Rebastinib (DCC-2036) by oral gavage at 100 mg/kg once daily effectively inhibits Bcr-Abl1 signaling and significantly prolongs mouse survival. [1]