A-966492

A-966492 est l'un des inhibiteurs de PARP les plus puissants. Ce composé présente une excellente puissance contre l'enzyme PARP-1 avec un K_i de 1 nM et un EC50 de 1 nM dans un test sur cellules entières. Il améliore significativement l'efficacité du TMZ de manière dose-dépendante. De plus, cette substance chimique est biodisponible par voie orale chez plusieurs espèces, traverse la barrière hémato-encéphalique et semble se distribuer dans les tissus tumoraux. Il représente un analogue de benzimidazole prometteur et structurellement diversifié et est en cours de caractérisation préclinique. [1]

A-966492 démontre également une bonne efficacité in vivo dans un modèle murin de mélanome sous-cutané B16F10 en combinaison et dans un modèle de xénogreffe de cancer du sein MX-1, à la fois en monothérapie et en combinaison. De plus, ce composé possède d'excellentes propriétés pharmaceutiques et a démontré une efficacité in vivo dans des modèles tumoraux murins précliniques en combinaison avec le TMZ, ainsi qu'une activité en monothérapie dans un modèle tumoral MX-1 déficient en BRCA1. Il est également caractérisé chez des rats Sprague-Dawley, des chiens beagle et des singes cynomolgus, cette substance chimique démontrant des biodisponibilités orales de 34 à 72 % et des demi-vies de 1,7 à 1,9 heures. In vivo, il démontre une amélioration significative de l'efficacité du TMZ dans un modèle syngénique de mélanome murin B16F10, les groupes de combinaison montrant une efficacité supérieure. [1]

• Essai enzymatique PARP

  L'essai enzymatique est réalisé dans un tampon contenant 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM dithiothréitol (DTT) et 4 mM MgCl₂. Les réactions PARP contiennent 1,5 μM [³H]-NAD⁺ (1,6 μCi/mmol), 200 nM d'histone H1 biotinylée, 200 nM d'ADNdb, et 1 nM d'enzyme PARP-1 ou 4 nM d'enzyme PARP-2. Les auto-réactions utilisant une détection basée sur des billes SPA sont réalisées dans des volumes de 100 μL dans des plaques à 96 puits blanches. Les réactions sont initiées par l'ajout de 50 μL de mélange de substrat NAD⁺ 2X à 50 μL de mélange enzymatique 2× contenant PARP et ADN. Ces réactions sont terminées par l'ajout de 150 μL de 1,5 mM de benzamide (environ 1 × 10³ fois son IC50). Une quantité de 170 μL des mélanges réactionnels arrêtés est transférée sur des plaques Flash Plates recouvertes de streptavidine, incubée pendant 1 heure et comptée à l'aide d'un compteur à scintillation de microplaques TopCount. Les données K_i sont déterminées à partir des courbes d'inhibition à diverses concentrations de substrat.

• Lignées cellulaires

  C41 cell

• Concentrations

  ~10 nM

• Temps dincubation

  30 minutes

• Méthode

  C41 cells are treated with A-966492 for 30 minutes in a 96-well plate. PARP are activated by damaging DNA with 1 mM H₂O₂ for 10 minutes. Cells are washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) once and fixed with prechilled methanol/acetone (7:3) at -20 °C for 10 minutes. After they are air-dried, plates are rehydrated with PBS and blocked using 5% nonfat dry milk in PBS-Tween(0.05%) (blocking solution) for 30 minutes at room temperature. Cells are incubated with anti-PAR antibody 10H (1:50) in blocking solution at room temperature for 60 minutes followed by washing with PBS-Tween20 five times, and incubation with goat antimouse 5(6)-isothiocyanate (FITC)-coupled antibody (1:50) and 1 μg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in blocking solution at room temperature for 60 minutes. After washing with PBS-Tween20 5 times, analysis is performed using an fmax Fluorescence Microplate Reader set at the excitation and emission wavelength for FITC or the excitation and emission wavelength for DAPI. PARP activity (FITC signal) is normalized with cell numbers (DAPI).

• Modèles animaux

  A 0.2 cc amount of a 1:10 dilution of tumor brei in 45% Matrigel and 45% Spinner MEM is injected subcutaneously into the flank of female SCID mice.

• Posologies

  12.5, 25, and 50 mg/kg/day, for 14 days

• Administration

  Orally administrated