Belinostat (PXD101)

Les cultures subconfluentes sont récoltées et lavées deux fois dans du PBS froid et mises en suspension par centrifugation à 200 × g pendant 5 min. Le culot cellulaire est remis en suspension dans deux volumes de tampon de lyse [tampon Tris 60 mM (pH 7,4) contenant 30 % de glycérol et 450 mM de NaCl] et lysé par trois cycles de congélation (glace sèche) et de décongélation (bain-marie à 30 °C). Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 1,2 × 10⁴ g pendant 5 min, et le surnageant est stocké à −80 °C. Le peptide d'histone H4 (séquence SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK correspondant aux 20 résidus NH2-terminaux) est acétylé par une protéine recombinante contenant le domaine hypoxanthine-aminoptérine-thymidine de p300, en utilisant du [³H]acétyl CoA comme source d'acétate. Le peptide H4 (100 μg) est mélangé avec du tampon hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (50 mM Tris HCl pH 8,0, 5 % de glycérol, 50 mM KCl et 0,1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-aminoéthyl) benzènesulfonylfluorure, 1 × inhibiteurs de protéase complets, 50 μL de p300 purifiée et 1,85 m de [³H]acétyl CoA (4,50 Ci/mmol) dans un volume final de 300 μL et incubé à 30 °C pendant 45 min. La protéine p300 est retirée par incubation avec 20 μL de billes de Ni-agaroase à 50 % pendant 1 heure à 4 °C et centrifugation. Le surnageant est appliqué à une colonne de Sephadex G15 de 2 mL, et le flux traversant est collecté. Un millilitre de H₂O distillée est délicatement appliqué, et trois fractions de goutte sont collectées ; ceci est répété jusqu'à ce que 4–5 mL de H₂O distillée aient été ajoutés, et ~40 fractions sont collectées. Trois microlitres de chaque fraction sont dilués dans 2 mL de liquide de scintillation et comptés dans un compteur à scintillation pour identifier les fractions contenant le peptide marqué. Ces fractions sont regroupées, et 1 μL de l'échantillon combiné est mesuré pour évaluer la radioactivité de chaque lot de peptide (3-7 × 10³ cpm/μL). Pour les essais d'activité, la réaction est réalisée dans un volume total de 150 μL de tampon [60 mM Tris (pH 7,4) contenant 30 % de glycérol] contenant 2 μL d'extrait cellulaire et, le cas échéant, 2 μL de ce composé. La réaction est démarrée par l'ajout de 2 μL de substrat marqué au [³H] (peptide d'histone H4 acétylé correspondant aux 20 résidus NH₂-terminaux). Les échantillons sont incubés à 37 °C pendant 45 min, et la réaction est arrêtée par l'ajout de HCl et d'acide acétique (concentrations finales de 0,72 et 0,12 M, respectivement). L'acétate [³H] libéré est extrait dans 750 μL d'acétate d'éthyle, et les échantillons sont centrifugés à 1,2 × 10⁴ g pendant 5 min. La phase supérieure (600 μL) est transférée dans 3 mL de liquide de scintillation et comptée.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.