Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

Pour l'essai kinase CDK1/cycline B1, les réactions de kinase consistent en 100 ng de complexe GST-CDK1/cycline B1 (humain) exprimé par baculovirus, 1 μg d'histone HI, 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM d'ATP dans 50 μL de tampon kinase (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0,5 mM DTT). Pour l'essai kinase CDK2/cycline E, les réactions de kinase consistent en 5 ng de complexe GST-CDK2/cycline E (humain) exprimé par baculovirus, 0,5 μg de protéine de fusion GST-RB (acides aminés 776-928 de la protéine du rétinoblastome), 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM d'ATP dans 50 μL de tampon kinase (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Pour l'essai kinase CDK4/cycline D1, les réactions de kinase consistent en 150 ng de GST-CDK4/cycline D1 (humain) exprimé par baculovirus, 280 ng de Stag-cycline D1, 0,5 μg de protéine de fusion GST-RB (acides aminés 776-928 de la protéine du rétinoblastome), 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM d'ATP dans 50 μL de tampon kinase (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Les réactions sont incubées pendant 45 minutes pour CDK1 et CDK2, ou 1 heure pour CDK4 à 30 °C et arrêtées par l'addition d'acide trichloroacétique froid (TCA) à une concentration finale de 15 %. Les précipités de TCA sont recueillis sur des plaques unifilter GF/C à l'aide d'un moissonneur universel Filtermate et les filtres sont quantifiés à l'aide d'un compteur à scintillation liquide TopCount à 96 puits. Le Flavopiridol (Alvocidib) est dissous à 10 mM dans du diméthylformamide (DMF) et évalué à six concentrations, chacune en triple. La concentration finale de DMF dans l'essai = 2 %. Les valeurs d'IC50 sont dérivées par analyse de régression non linéaire et ont un coefficient de variation = 16 %. Pour évaluer son activité sur CDK6, un essai de liaison sur filtre est établi. Les éléments suivants sont combinés dans le mélange réactionnel : 2 μL de CDK6 (0,7 mg/μL), 5 μL d'histone H1 (6 mg/mL), 14 μL de tampon kinase (60 mM β-glycérophosphate, 30 mM p-nitrophényl phosphate, 25 mM MOPS (pH 7,0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM Na-vanadate), 3 μL de concentrations croissantes de ce composé diluées dans 50 % de DMSO, et 6 μL de ³³P-ATP (1 mCi/mL) dans de l'ATP non radioactif à une concentration de 90 μM (concentration finale : 15 μM). L'essai est initié par l'addition de ³³P-ATP. La réaction est incubée pendant 20 minutes à 30°C. Une aliquote de 25 μL du surnageant est ensuite déposée sur du papier phosphocellulose Whatman P81. Les filtres sont lavés 5 fois avec une solution d'acide phosphorique à 1 %. Les filtres humides sont comptés en présence de 1 mL de liquide de scintillation. L'activité de Cdk9 est mesurée en utilisant 50 nM de Cdk9/cycline T recombinant dans 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM de peptide CDT de l'ARN polymérase et 80 μM d'ATP. L'essai Cdk7 est réalisé dans le même tampon en utilisant 37 nM de kinase purifiée en présence de 200 μM d'ATP et 10 μM de protéine de liaison à la myéline comme substrat. La puissance de ce composé envers CDK9 et CDK7 est déterminée en utilisant soit un essai basé sur un échangeur d'anions fort (résine Dowex 1-X8, forme formate) soit un essai de scintillation de proximité. Les valeurs d'IC50 sont calculées à partir des courbes dose-réponse.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.