OSI-027

OSI-027 présente des activités d'inhibition sélectives et compétitives de l'ATP contre mTORC1 et mTORC2 avec une IC50 de 22 nM et 65 nM, respectivement. De plus, ce composé inhibe la signalisation mTOR de phospho-4E-BP1 avec une IC50 de 1 μM dans des essais cellulaires. [1] Il présente des activités antiprolifératives contre plusieurs lignées cellulaires de leucémie aiguë d'origine myéloïde/mégacaryocytaire de manière dose-dépendante, y compris les cellules U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 et MEG-01. [2] Une étude récente montre que l'inhibition de mTORC1/2 par cette substance chimique supprime efficacement la phosphorylation d'Akt (S473) et la prolifération cellulaire dans les cellules de cancer du sein. [3]

Dans le xénogreffe colorectal GEO, OSI-027 (65 mg/kg) inhibe les effecteurs mTORC1 et mTORC2, y compris la phosphorylation de 4E-BP1, Akt et S6. De plus, l'inhibition combinée de mTORC1 et mTORC2 par ce composé inhibe la croissance tumorale plus puissamment que l'inhibition de mTORC1 par la rapamycine. [1]

• Essais biochimiques

  L'inhibition de mTORC1 et mTORC2 est évaluée à l'aide d'un complexe enzymatique natif immunoprécipité à partir de lysats de HeLa à 1 mM d'ATP. Pour préparer les lysats cellulaires entiers à partir de cellules HeLa, 25 g de culot cellulaire sont lysés dans 60 mL de tampon A glacé [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM pyrophosphate de sodium, 10 mM glycérophosphate, 50 mM NaF, 0,5 mM orthovanadate, et inhibiteurs de protéase sans EDTA contenant 0,3 % de CHAPS] pendant 30 minutes sur un agitateur magnétique dans une chambre froide. Après clarification des lysats par centrifugation à 13 000 g pendant 10 minutes, des plaques à 384 puits revêtues de protéine G sont incubées avec 0,25 μg d'anticorps mTOR dans 15 μL de tampon A pendant 1 heure à 4 °C. À chaque puits, 40 μg de lysat de cellules HeLa dans 15 μL de tampon A sont ajoutés et incubés pendant la nuit à 4 °C pour immunoprécipiter les complexes mTOR. Les plaques sont lavées 3 fois avec le tampon A et deux fois avec le tampon de lavage d'immunoprécipitation [Tampon B : 50 mM HEPES (pH 7,5) et 150 mM NaCl]. OSI-027 est ajouté à une concentration de 10 μM à chaque puits et le DMSO est ajouté aux puits témoins. La réaction est initiée par l'ajout de 150 ng de 4E-BP1 marqué His comme substrat en présence ou en l'absence de 100 μM d'ATP à chaque puits dans 25 μL de tampon de kinase fraîchement préparé [Tampon C : 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-mercaptoéthanol et 200 μM de vanadate] et incubée à température ambiante (TA) pendant 30 minutes. La réaction est arrêtée par transfert de 25 μL de mélange réactionnel de chaque puits vers les puits correspondants de nouvelles plaques revêtues de chélate de Ni et incubée pendant la nuit à 4 °C, suivie de 2 heures à 37 °C. Pour détecter la phosphorylation de 4E-BP1, les plaques sont lavées une fois avec du TBST (solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20) contenant 5 % de lait écrémé en poudre. À chaque puits, 25 μL d'anticorps phospho-4E-BP1 dilués au 1:1 000 dans du TBST contenant 5 % de lait écrémé sont ajoutés et incubés pendant 1 heure à TA. Les plaques sont lavées une fois avec du TBST, puis 25 μL de HRP anti-lapin (dilué au 1:10 000) dans du TBST contenant 5 % de lait écrémé sont ajoutés. Les plaques sont incubées pendant 1 heure à TA et lavées 5 fois avec du TBST. Pour la détection de phospho-4E-BP1, 25 μL de réactifs chimioluminescents A+B sont ajoutés et la chimioluminescence est mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques Analyst.

• Lignées cellulaires

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Concentrations

  0-10 μM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Modèles animaux

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Posologies

  ≤65 mg/kg

• Administration

  Administered via gavage.