Pemetrexed Disodium (LY231514)

L'activité de la TS est mesurée à l'aide d'une méthode spectrophotométrique, qui implique le suivi de l'augmentation de l'absorbance à 340 nm résultant de la formation du produit, le 7,8-dihydrofolate. Le tampon d'essai contient 50 mM d'acide N-tris[hydroxyméthyljméthyl-2-aminoéthanesulfonique, 25 mM de MgC1₂, 6,5 mM de formaldéhyde, 1 mM d'EDTA et 75 mM de 2-mercaptoéthanol, pH 7,4. Les concentrations de désoxyuridylate monophosphate, de 6R-MTHF et de hIS sont de 100 μM, 30 μM et 30 nM (1,7 milliunité/mL), respectivement. À la concentration de 6R-MTHF, une réaction non inhibée et six concentrations d'inhibiteur sont testées. Les valeurs de K_{i app} sont déterminées en ajustant les données à l'équation de Morrison à l'aide d'une analyse de régression non linéaire avec l'aide du programme ENZFITTER. Les valeurs de K_i sont calculées à l'aide de l'équation : K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), où [S] est égal à 30 μM et K_m est égal à 3 μM. L'activité de la DHFR est mesurée spectrophotométriquement en suivant la disparition des substrats NADPH et 7,8-dihydrofolate à 340 nm. La réaction a lieu à 25°C dans 0,5 mL de tampon phosphate de potassium 50 mM, qui contient 150 mM de KC1 et 10 nM de 2-mercaptoéthanol, pH 7,5, et 14 nM (0,34 milliunité/mL) de DHFR. La concentration de NADPH est de 10 μM et le 7,8-dihydrofolate est varié à 5, 10 ou 15 μM. À chaque concentration de 7,8-dihydrofolate, une réaction non inhibée et sept concentrations d'inhibiteur sont testées. Le programme micro-informatique ENZFITI'ER est utilisé pour obtenir les valeurs de K_{i app} en ajustant les données à l'équation de Morrison par analyse de régression non linéaire. K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), où [S] est égal à la concentration de 7,8-dihydrofolate utilisée et K_m du 7,8-dihydrofolate est égal à 0,15 μM. L'activité de la GARFT est mesurée spectrophotométriquement en suivant l'augmentation de l'absorbance résultant de la formation du produit 5,8-didéazafolate à 295 nm. Le solvant de réaction contient 75 mM de HEPES, 20 % de glycérol et 50 mM d'a-thioglycérol, pH 7,5, à 25°C. Les concentrations de substrats et d'enzyme utilisées sont 10 μM d'α,β-glycinamide ribonucléotide, 0-10 μM d'acide 10-formyl-5,8-didéazafolique et 10 nM (1,9 milliunité/mL) de GARFT. Les valeurs de K_i sont calculées à l'aide du programme Enzyme Mechanism du spectrophotomètre Beckman DU640, qui utilise une analyse de régression non linéaire pour ajuster les données à l'équation de Michaelis-Menten pour l'inhibition compétitive.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.