SB743921 HCl

Les domaines moteurs de KSP (acides aminés 1 à 360) sont exprimés dans Escherichia coli BL21(DE3) sous forme de protéines de fusion 6-His C-terminales. Les culots bactériens sont lysés dans un microfluidiseur avec un tampon de lyse [50 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl₂, 8 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM ATP (pH 7,4)], et les protéines sont purifiées par chromatographie d'affinité sur agarose Ni-NTA, avec un tampon d'élution composé de 50 mM PIPES, 10% de saccharose, 300 mM imidazole, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, mM β-mercaptoéthanol et 0,1 mM ATP (pH 6,8). Les mesures de l'activité ATPase à l'état stable sont effectuées avec un système de détection pyruvate kinase–lactate déshydrogénase qui couple l'apparition d'ADP à l'oxydation du NADH. Les changements d'absorbance sont surveillés à 340 nm. Toutes les expériences biochimiques sont réalisées dans un tampon PEM25 [25 mM Pipes/KOH (pH 6,8), 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA] supplémenté avec 10 μM SB 743921 pour les expériences impliquant des microtubules. Les taux de libération d'ADP sont mesurés dans un appareil à flux stoppé ; la diminution de la fluorescence du MANT-ATP est surveillée. Les taux de libération de Pi sont mesurés dans un appareil à flux stoppé, en utilisant une protéine bactérienne de liaison au phosphate modifiée avec le colorant 7-diethylamino-3-((((2 maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl)coumarin (MDCC). Les estimations de K_i des inhibiteurs de KSP sont extraites des courbes dose-réponse, avec une correction explicite de la concentration enzymatique. La polymérisation de la tubuline par la mesure des changements d'absorbance à 340 nm est surveillée. L'essai est réalisé en volumes de 100 μL dans des plaques de microtitration à 96 puits à demi-surface, en utilisant un lecteur de microplaques avec la température d'incubation réglée à 37 °C.

HeLa cells

~1 μM

24 hours

All cells including HeLa cells are cultured in 10% FCS in RPMI 1640 in 5% CO₂. We assessed 48-hour growth inhibition by serial dilution of SB 743921 relative to DMSO-treated cells in 96-well microtiter plates, using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium. Cell growth is represented as the ratio of absorbance of treated cells to DMSO control, plotted by concentration and fitted to a four-parameter curve. Concentrations at which cellular growth is inhibited by 50% are extrapolated from the curve fit. The DNA content of HeLa cells cultured in the presence or absence of 1 μM SB 743921 for 24 hours is assessed by propidium iodide staining and flow cytometry. Immunofluorescence images are collected of HeLa cells treated for 24 hours with 1 μM SB 743921, fixed with 2% formaldehyde, permeabilized, and stained with DM1-α, anti-γ-tubulin, and 1 μg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole, and with Alexa 488 secondary goat antirabbit IgG and Rhodamine-X goat antimouse IgG. Images are collected with a DeltaVision Restoration Microscopy System at a magnification of ×600. Z stacks (0.2 μm) are collected, and out of focus information is removed by constrained iterative deconvolution. Z stacks are then compressed into to a single image plane.

Female BDF1 mice with P388 lymphocytic leukemia cells

7.5 mg/kg- 30 mg/kg

Administered via i.p.