Foretinib

L'inhibition de la kinase est étudiée en utilisant l'un des trois formats d'essai : transfert de [³³P]phosphoryle, chimioluminescence couplée à la luciférase, ou technologie AlphaScreen Protein Tyrosine Kinase. Les IC50 sont calculées par analyse de régression non linéaire en utilisant XLFit. Essai de Kinase par Transfert de ³³P-Phosphoryle Les réactions sont effectuées dans des microplaques de 384 puits blanches, à fond clair et à forte liaison (Greiner, Monroe, NC). Les plaques sont recouvertes de 2 μg/puits de protéine ou de substrat peptidique dans un volume de 50 μL de tampon de revêtement contenant 40 μg/mL de substrat (poly(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO₃, 27,5 mM NaHCO₃, 50 mM NaCl et 3 mM NaN₃. Les plaques recouvertes sont lavées une fois avec 50 μL de tampon d'essai après une incubation d'une nuit à température ambiante (TA). Les composés d'essai et les enzymes sont combinés avec du ³³P-γ-ATP (3,3 μCi/nmol) dans un volume total de 20 μL. Le mélange réactionnel est incubé à TA pendant 2 heures et la réaction est arrêtée par aspiration. Les microplaques sont ensuite lavées 6 fois avec un tampon Tween-PBS (PBST) à 0,05%. Du liquide de scintillation (50 μL/puits) est ajouté et le ³³P incorporé est mesuré par spectrométrie de scintillation liquide à l'aide d'un compteur de scintillation MicroBeta. Essai de Chimioluminescence Couplée à la Luciférase Les réactions sont menées dans des microplaques blanches de 384 puits à liaison moyenne (Greiner). Dans une première étape, l'enzyme et le composé sont combinés et incubés pendant 60 minutes ; les réactions sont initiées par l'addition d'ATP et de substrat peptidique (poly(Glu, Tyr) 4:1) dans un volume final de 20 μL, et incubées à TA pendant 2 à 4 heures. Après la réaction de la kinase, une aliquote de 20 μL de Kinase Glo (Promega, Madison, WI) est ajoutée et le signal de luminescence est mesuré à l'aide d'un lecteur de plaque Victor. La consommation totale d'ATP est limitée à 50%. Essai de Protein Tyrosine Kinase AlphaScreen™ Des billes donneuses recouvertes de streptavidine et des billes accepteuses recouvertes d'anticorps anti-phosphotyrosine PY100 sont utilisées. Le poly(Glu,Tyr) 4:1 biotinylé est utilisé comme substrat. La phosphorylation du substrat est mesurée par l'addition de billes donneuses/accepteuses par luminescence après la formation du complexe bille donneuse-accepteuse. La kinase et les composés d'essai sont combinés et préincubés pendant 60 minutes, suivis de l'ajout d'ATP et de poly(Glu, Tyr) biotinylé dans un volume total de 20 μL dans des microplaques blanches de 384 puits à liaison moyenne (Greiner). Les mélanges réactionnels sont incubés pendant 1 heure à température ambiante. Les réactions sont stoppées par l'ajout de 10 μL d'une suspension de billes AlphaScreen de 15-30 μg/mL contenant 75 mM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl, 120 mM EDTA, 0,3% BSA et 0,03% Tween-20. Après 2 à 16 heures d'incubation à température ambiante, les plaques sont lues à l'aide d'un lecteur AlphaQuest.

B16F10, A549, and HT29 cells

40 nM

12 to 14 days

B16F10, A549, and HT29 cells (1.2× 10³ per well) are mixed with soft agar and seeded in a 96-well plate containing 10% FBS and EXEL-2880 over a base agar layer. For normoxic conditions, the plates are incubated (37°C) for 12 to 14 days in 21% oxygen, 5% CO₂, and 74% nitrogen, whereas incubation (37 °C) under hypoxic conditions is done in a hypoxia chamber in 1% oxygen, 5% CO₂, and 94% nitrogen. The number of colonies is evaluated under each condition following addition of 50% Alamar Blue and fluorescence detection.

B16F10 tumor cells (2 × 10 ⁵) are implanted via i.v. tail vein injection into athymic nude mice (NCr or BALB/c) 5 to 8 weeks old

100 mg/kg

Administered via oral gavage