ZSTK474

ZSTK474 à 1 μM réduit puissamment l'activité de la PI3K à 4,7 % du niveau de contrôle, tandis que le LY2194002 ne réduit l'activité qu'à 44,6 % du contrôle. Ce composé inhibe les activités des p110β, -γ et -δ recombinantes avec des IC50 de 17 nM, 53 nM et 6 nM, respectivement. Il présente une puissante activité antiproliférative contre un panel de 39 lignées cellulaires cancéreuses humaines avec une GI50 moyenne de 0,32 μM, plus efficacement que celle du LY294002 ou de la wortmannine avec une GI50 moyenne de 7,4 μM ou 10 μM, respectivement. Ce traitement chimique à 1 μM bloque le ruffling membranaire et la génération de PIP3 induite par le facteur de croissance dérivé des plaquettes dans les fibroblastes embryonnaires murins (MEF). Il à 10 μM induit l'apoptose dans les cellules OVCAR3, et induit un arrêt complet en phase G1 mais pas l'apoptose dans les cellules A549. Ce traitement composé à 0,5 μM diminue significativement le niveau d'Akt et de GSK-3β phosphorylés, ainsi que l'expression de la protéine cycline D1. Il inhibe également la phosphorylation d'autres composants de signalisation en aval qui sont impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire, y compris FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR et p70S6K de manière dose-dépendante. [1] Ce produit chimique n'inhibe pas mTOR à 0,1 μM, et même à une concentration de 100 μM, il inhibe l'activité de mTOR de moins de 40 %. [2] Il bloque la migration cellulaire induite par le VEGF et la formation de tubes dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et inhibe l'expression de HIF-1α et la sécrétion de VEGF dans les cellules RXF-631L, présentant une puissante activité antiangiogénique in vitro. [3] Ce traitement composé inhibe la production d'IFNγ et d'IL-17 dans les lymphocytes T activés par la concanavaline A, et inhibe la prolifération et la production de PGE(2) par les cellules synoviales de type fibroblaste (FLS). [6]

• Inhibition de l'activité PI3K

  Les cellules A549 sont lysées dans un tampon contenant 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA et 1 % Igepal CA-630, les lysats sont centrifugés à 20 000 g et 4 °C pendant 10 minutes, et les surnageants sont utilisés comme lysat cellulaire (protéine = 2-4 mg/mL). Pour immunoprécipiter la PI3K, 200 μL de lysat cellulaire sont incubés avec un anticorps polyclonal anti-p85 et de la protéine G-agarose (5 μL). Les PI3Kα, PI3Kβ et PI3Kδ peuvent être immunoprécipitées par l'anticorps polyclonal anti-p85. Les billes d'agarose contenant les immunoprécipités sont lavées deux fois avec le tampon A (20 mM Tris-HCl à pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA et 1 % Igepal CA-630), une fois avec le tampon B (500 mM LiCl et 100 mM Tris-HCl à pH 7,5), une fois avec de l'eau distillée et une fois avec le tampon C (100 mM NaCl et 20 mM Tris-HCl à pH 7,5). Les immunoprécipités sont suspendus dans 20 μL de tampon C contenant du phosphatidylinositol à 200 μg/mL. Le mélange est préincubé avec des concentrations croissantes de ce composé à 25 °C pendant 5 minutes. Le [γ-³²P]ATP (2 μCi par mélange d'essai ; concentration finale, 20 μM) et le MgCl₂ (concentration finale, 20 mM) sont ajoutés pour démarrer la réaction. Le mélange réactionnel est incubé à 25 °C pendant 20 minutes. Les produits phosphorylés du phosphatidylinositol sont séparés par chromatographie sur couche mince et visualisés par autoradiographie. La région du phosphatidylinositol-3-phosphate est raclée de la plaque, et la radioactivité est également mesurée par spectroscopie à scintillation liquide. Le niveau d'inhibition de ce produit chimique est déterminé comme le pourcentage de comptes ³²P par minute obtenus sans ce composé.

• Lignées cellulaires

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Temps dincubation

  48 hours

• Méthode

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• Modèles animaux

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• Posologies

  ~400 mg/kg/day

• Administration

  Orally