Bafilomycin A1 (Baf-A1)

Le milieu d'essai enzymatique ATPase contient 6 mM de MgSO₄, 50 mM de HEPES (pH 7,4), 200 mM de Na₂SO₃ (activateur de V-ATPase), 0,5 mM d'ortho-vanadate de sodium (inhibiteur de P-ATPase), 0,5 mM d'azide de sodium (inhibiteur de F-ATPase) et 3 mM de Na₂ATP. Ce milieu (1,0 mL), avec ou sans addition de l'inhibiteur de l'ATPase de type V Bafilomycin A1 (Baf-A1), est incubé avec l'homogénat filtré (0,1 mL) pendant 60 minutes à 23–25 °C. La réaction est arrêtée par l'addition de 1 mL de TCA à 3%. Des blancs spectrométriques sont préparés comme pour le dosage enzymatique, à l'exception que l'échantillon de tissu est ajouté après l'acide. L'analyse des phosphates est effectuée en ajoutant 2 mL de 1-butanol et 0,2 mL de solution de molybdate (5 g de molybdate d'ammonium, 22 mL de H₂SO₄ pour 100 mL). Après avoir vortexé pendant 15 secondes, la solution est neutralisée avec 0,5 mL de solution de citrate (100 g/500 mL, pH 7,0) et de nouveau vortexée pendant 15 secondes. La solution est ensuite centrifugée (2000 × g; 3 minutes) pour séparer la phase butanolique et l'absorbance de cette phase est lue à 400 nm. Des étalons d'orthophosphate sont préparés (0,1 μM–2,0 μM) et traités de la même manière que les essais d'activité enzymatique. L'activité enzymatique est exprimée en μmol d'orthophosphate libéré par heure et par milligramme de protéine. L'activité V-ATPase est considérée comme la différence entre l'activité ATPase totale mesurée en présence de Na₂SO₃, d'orthovanadate de sodium et d'azide de sodium et l'activité ATPase mesurée en présence de ces réactifs et de ce composé.

HeLa cells

~20 nM

20 hours

H. pylori bacteria extract is treated with inhibitors, before addition to HeLa cells, as follows: DCCD 10 mM for 1 hour at 30 ºC; NBD-CI 100 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked with glycine 10 mM final concentration; NEM 275 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked by addition of β-mercaptoethanol 275 mM; Mg-ATP 14 μM for 1 hour at 0 ºC; 100 μM KNO₃ and 14 μM Mg-ATP for 1 hour at 30 μM; NaCO₃ 100 μM, pH 11 for 1 hour at 0 ºC. The bacterial extract is then added to cell with a 40-fold dilution at a final concentration of 0.65 mg/mL. Controls are HeLa cells incubated with untreated bacterial extracts and cells treated with Bafilomycin A1 (Baf-A1) under the same conditions as bacterial extracts, at the same concentrations or after a 40-fold dilution. The vacuotating activity of the bacterial extracts is assayed.

Young (approximately 9 days old) Mozambique tilapia, Oreochromis mossambicus

10 μM

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