BRD4770

Les dosages immuno-enzymatiques au lanthane à fluorescence améliorée par dissociation (DELFIA) sont réalisés dans des plaques à 384 puits blanches et opaques, revêtues de Neutravidin. Les composés testés sont dilués à 12 μg/mL dans 50mM Tris-HCl pH 8,5 contenant 4% de DMSO et 10 μL sont distribués dans les puits. Les puits blancs et de contrôle n'ont reçu que le tampon du composé. Le GST-G9a à 10 μg/mL et le SAM à 40 μM sont dilués dans 50mM Tris HCl pH 8,5/10 mM DTT et ajoutés dans un volume de 20 μL. Les puits blancs reçoivent uniquement le tampon Tris/DTT. Les réactions sont initiées par l'addition de 800 nM de substrat H3(1-20)-cysbiotin dans 50 mM Tris pH 8,5 dans un volume de 10 μL, et incubées à température ambiante pendant 60 minutes. Les plaques sont lavées 3 fois avec 100 μL de tampon de lavage (50mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,2% BSA). Ensuite, 50 μL de tampon de dosage fluoro-immunologique (FI) (50 mM Tris HCl pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 40, 25 μM DTPA, 0,2% BSA, 0,05% BGG) contenant 5ng d'α-2X-di-meth H3-K9 et 5ng de chélate d'Eu anti-lapin de chèvre sont ajoutés à tous les puits de la plaque, et la plaque est incubée pendant une heure supplémentaire à température ambiante. Les plaques sont lavées 3 fois avec 100 μL de tampon de lavage, et 50 μL de solution d'amélioration sont ajoutés à chaque puits. La fluorescence résolue dans le temps est mesurée après 45 minutes sur un imageur de microplaques Viewlux, avec une imagerie de 15 secondes avec une fenêtre de 354 μs, un délai de 400 μs, une excitation à 360 nm et une émission à 618 nm.

PANC-1 cells

~20 μM

72 hours

PANC-1 cells are seeded and treated with BRD4770 in 6-well plates for 72 h. Cells are trypsinized and tested for soft agar colony formation using CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay, using the CyQuant GR dye to measure total cellular nucleic acid levels. Fluorescence is detected with an Analyst HT plate reader using a 485/520 nm filter set.