BX-795

Le BX-795 bloque efficacement l'activité de PDK1 dans les cellules PC-3, comme le montre leur capacité à bloquer la phosphorylation de S6K1, Akt, PKCδ et GSK3β. Ce composé inhibe puissamment la croissance des cellules tumorales sur plastique avec un IC50 de 1,6, 1,4 et 1,9 μM pour les cellules MDA-468, HCT-116 et MiaPaca, respectivement. Dans l'agar mou, il présente une inhibition de croissance plus élevée avec un IC50 de 0,72 et 0,25 μM pour les cellules MDA-468 et PC-3, respectivement. [1]

De plus, ce produit chimique, en tant qu'inhibiteur de TBK1/IKKɛ, bloque l'activation d'IRF3 médiée par TBK1 et IKKε et la production d'IFN-β. [2]

Dans les réponses physiologiques des plaquettes, ce composé produit un effet inhibiteur sur l'agrégation induite par le 2-MeSADP ou le collagène, la sécrétion d'ATP et la production de thromboxane. [3]

Le BX-795, un inhibiteur de TBK-1 et PDK-1, inhibe également la traduction des protéines HSV.

• Essais kinases

  PDK1 est dosée dans un essai kinase direct et un format d'essai couplé mesurant l'activation d'AKT2 médiée par PDK1 et PtdIns-3,4-P2. Pour l'essai couplé, le mélange réactionnel final (60 μL) contenait : 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL d'albumine sérique bovine, 18 mM de β-glycérophosphate, 0,7 mM de dithiothréitol, 3 mM d'EGTA, 10 mM de MgOAc, 7,5 μM d'ATP, 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7,5 μM de substrat peptidique biotinylé (biotine-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL de vésicules phospholipidiques contenant PtdIns-3,4-P2, 60 pg de PDK1 humain recombinant purifié et 172 ng d'AKT2 humain recombinant purifié. Après incubation pendant 2 h à température ambiante, le peptide marqué à la biotine est capturé à partir de 10 μL du mélange réactionnel sur des billes SPA revêtues de streptavidine, et la formation du produit est mesurée par scintillation de proximité dans un compteur Wallac MicroBeta. Le produit formé est proportionnel au temps d'incubation et à la quantité de PDK1 et d'AKT2 inactive ajoutés. Ce composé est ajouté à des niveaux sous-optimaux afin que l'essai puisse détecter de manière sensible les inhibiteurs de l'activation d'AKT2 ainsi que les inhibiteurs directs de PDK1 ou d'AKT2. Pour mesurer directement l'activité de PDK1, le mélange réactionnel final (60 μL) contenait 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% de β-mercaptoéthanol, 1 mg/mL d'albumine sérique bovine, 10 mM de MgOAc, 10 μM d'ATP, 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7,5 μM de peptide substrat (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) et 60 ng de PDK1 humain recombinant purifié. Après 4 h à température ambiante, nous ajoutons 25 mM d'EDTA et déposons une portion du mélange réactionnel sur du papier phosphocellulose Whatman P81. Le papier filtre est lavé trois fois avec de l'acide phosphorique à 0,75% et une fois avec de l'acétone. Après séchage, le peptide marqué lié au filtre est quantifié à l'aide d'un phosphorimageur Fuji.

• Lignées cellulaires

  MDA-468, PC-3, HCT-116 and MiaPaca cells

• Concentrations

  ~10 μM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  Cells seeded at a low density (1,500–3,000 cells/well, 0.1 mL/well, 96-well plates) are incubated overnight. Compound treatments are made by adding 10 μL/well of this compound in 1% dimethyl sulfoxide and growth medium (final concentration of dimethyl sulfoxide, 0.1%), followed by brief shaking. Treated cells are incubated for 72 hours, and viability is measured by the addition of 10 μL of the metabolic dye WST-1. The WST-1 signal is read in a plate reader at 450 nm, and a no cell, or zero time cell, background is subtracted to calculate the net signal. Results are reported as the average ± S.E. of two or more replicates.