PR-171 (Carfilzomib)

Le Carfilzomib (PR-171) inhibe la prolifération dans une variété de lignées cellulaires et de cellules néoplasiques dérivées de patients, y compris le myélome multiple, et a induit des voies de signalisation apoptotique intrinsèques et extrinsèques et l'activation de la kinase c-Jun-N-terminale (JNK). Il révèle une activité anti-MM améliorée, surmonte la résistance à d'autres agents et agit en synergie avec (Dex). Ce composé montre une puissance inhibitrice in vitro préférentielle contre l'activité ChT-L dans la sous-unité β5, avec plus de 80 % d'inhibition à des doses de 10 nM. Une courte exposition à une faible dose de Carfilzomib entraîne une spécificité de liaison préférentielle pour le β5 Proteasome constitutif 20S et les sous-unités immunoprotéasomes β5i. La mesure de l'activité des caspases dans les cellules ANBL-6 pulsées avec ce composé révèle des augmentations substantielles de l'activité des caspases-8, caspase-9 et caspase-3 après 8 heures, donnant respectivement une augmentation de 3,2, 3,9 et 6,9 fois par rapport aux cellules témoins après 8 heures. Dans les cellules traitées par pulsation de carfilzomib, l'intégrité de la membrane mitochondriale est diminuée à 41 % (Q1 + Q2), comparativement à 75 % dans les cellules témoins traitées par véhicule. [1] Dans une autre étude, il a également montré une efficacité préclinique contre les hémopathies malignes et les tumeurs solides. [2] Il inhibe directement la formation des ostéoclastes et la résorption osseuse. [3]

Le Carfilzomib (PR-171) réduit modérément la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe in vivo. Il diminue efficacement la viabilité des cellules du myélome multiple après un traitement continu ou transitoire. Ce composé augmente également le volume osseux trabéculaire, diminue la résorption osseuse et améliore la formation osseuse chez les souris sans tumeur. [3]

• Test immunoenzymatique pour le profilage des sous-unités du Carfilzomib

  Les cellules ANBL-6 (2 × 10⁶/puits) sont ensemencées dans des plaques à 96 puits et traitées avec du Carfilzomib (PR-171) à des doses allant de 0,001 à 10 μM pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite lysées (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA), et les lysats clarifiés sont transférés dans des plaques de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une courbe standard est générée en utilisant des lysats de cellules ANBL-6 non traitées, en commençant par une concentration de 6 μg de protéine/μL. La sonde de site actif [biotine-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-époxycétone; 20 μM] est ajoutée et incubée à température ambiante pendant 1 heure. Les lysats cellulaires sont ensuite dénaturés en ajoutant 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) et en chauffant à 100 °C, puis en mélangeant avec 20 μL par puits de billes de streptavidine-sépharose haute performance dans une plaque multiscreen DV à 96 puits et incubées pendant 1 heure. Ces billes sont ensuite lavées avec un tampon d'essai immunoenzymatique (ELISA) (PBS, 1 % d'albumine de sérum bovin et 0,1 % de Tween-20) et incubées pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur de plaques avec des anticorps contre les sous-unités du Proteasome. Les anticorps utilisés comprenaient des anticorps monoclonaux de souris anti-β1, anti-β2, anti-β1i et anti-β5i, des anticorps polyclonaux de chèvre anti-β2i et des anticorps polyclonaux de lapin anti-β5 (antisérum purifié par affinité contre le peptide KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS). Les billes sont lavées et incubées pendant 2 heures avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort de chèvre anti-lapin, de chèvre anti-souris ou de lapin anti-chèvre. Après lavage, les billes sont développées à l'aide du substrat de picochemiluminescence Supersignal ELISA. La détection luminescente est effectuée. La luminescence brute est convertie en μg/mL par comparaison avec la courbe standard et exprimée en % d'inhibition par rapport au contrôle véhicule. Les ajustements de courbe sont générés à l'aide de l'équation de dose-réponse non sigmoïdale suivante : Y = Bas + (Haut-Bas)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × HillSlope)), où X est le logarithme de la concentration, Y est le % d'inhibition et EC50 est la dose de ce composé montrant un effet de 50 %.

• Lignées cellulaires

  WST-1, ANBL-6 cells

• Concentrations

  100 nM

• Temps dincubation

  1 hour

• Méthode

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Modèles animaux

  Beige-nude-XID mice

• Posologies

  2.0 mg/kg

• Administration

  i.v.