Rebastinib (DCC-2036)

L'activité de u-Abl1native est déterminée en suivant la production d'ADP à partir de la réaction de la kinase par couplage avec le système pyruvate kinase/lactate déshydrogénase. Dans cet essai, l'oxydation du NADH (mesurée comme une diminution de A340nm) est surveillée en continu par spectrophotométrie. Le mélange réactionnel final (100 μL, dans une plaque Corning à 384 puits) est préparé comme suit : Un mélange de composants d'essai couplé Abl1 kinase est préparé contenant de l'u-Abl1 kinase (1 nM), de l'Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), du MgCl₂ (9 mM), de la pyruvate kinase (~ 4 unités), de la lactate déshydrogénase (~ 0,7 unités), du phosphoénol pyruvate (1 mM) et du NADH (0,28 mM) dans 90 mM Tris contenant 0,1 % d'octyl-glucoside et 1 % de DMSO, pH 7,5. Séparément, un mélange d'inhibiteur est préparé contenant du Rebastinib (DCC-2036) dilué en série 3 fois dans du DMSO, puis dilué dans un tampon composé de 180 mM Tris, pH 7,5, contenant du MgCl₂ (18 mM) et 0,2 % d'octyl-glucoside. Cinquante μL du mélange d'inhibiteur sont mélangés avec 50 μL du mélange de composants d'essai couplé Abl1 kinase ci-dessus, qui est ensuite incubé à 30 °C pendant 2 heures avant que 2 μL d'ATP 25 mM (500 μM, final) ne soient ajoutés pour démarrer la réaction. La réaction est enregistrée toutes les 2 minutes pendant 2,5 heures à 30 °C sur un lecteur de plaques Polarstar Optima ou Synergy2. Le taux de réaction (pente) est calculé en utilisant la période de 1 à 2 heures avec le logiciel du lecteur. Le pourcentage d'inhibition est obtenu par comparaison du taux de réaction avec celui d'un contrôle DMSO. Les valeurs d'IC50 sont calculées à partir d'une série de pourcentages d'inhibition déterminés à différentes concentrations d'inhibiteur à l'aide de GraphPad Prism. L'essai kinase pour Abl1T315I, p-Abl1native ou Abl1H396P est réalisé de la même manière que ci-dessus, sauf que 2,2 nM d'Abl1T315I, 1 nM de p-Abl1 native ou 1,3 nM d'Abl1H396P sont utilisés. Le format d'essai ci-dessus est également utilisé pour les kinases autres que Abl1 à l'exception de TIE2, pour lequel un format de polarisation de fluorescence/Transcreener est utilisé. Les conditions d'essai sont les mêmes que celles décrites ci-dessus, sauf que le PolyE4Y (1 mg/mL final) est utilisé comme substrat et qu'une préincubation d'une heure est utilisée.

Ba/F3 cells and primary Ph⁺ leukemia cells

0-10 μM

72 hours

Ba/F3 cells or primary Ph⁺ leukemia cells are plated in triplicate in 96-well plates containing test compounds. After 72 hours, viable cells are quantified by Resazurin or MTT assay. Cells are diluted in medium to be added to each well of a 96-well tissue culture-treated plate. All cells are incubated overnight and maintained in a humidified atmosphere at 37 °C and 5% CO₂. Cells are treated the following day. Serum-free medium is used during treatment with Rebastinib (DCC-2036). MTT is used to assess the viability of cells following treatment. Aliquots of 20 mL of stock MTT solution are added to each well containing 200 mL of medium (10% final solution) and incubated with the cells for 2 hours. Following incubation the medium is removed and 200 mL of dimethylsulfoxide added to solubilize the formazan crystals. The absorbance is read on the plate reader at 550 and 690 nm. A subtraction analysis of the dual wavelength is performed (D550 to D690) to increase accuracy of the measurement.

Ba/F3 cells transformed to interleukin-3 independence by transduction with either Bcr-Abl1^native or Bcr-Abl1^T315I retrovirus are injected intravenously into syngeneic Balb/c mice.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.