Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

L'activité de la Dynamine I est mesurée dans son état d'activité SAI ou est stimulée par trois méthodes différentes. Étant donné que chaque stimulus active la dynamine à des degrés différents, chaque essai nécessite des concentrations de dynamine différentes. Premièrement, l'activité maximale de la dynamine est stimulée par des liposomes de PS sonicés. La Dynamine I purifiée (10–20 nM, diluée dans : 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl et 0,01 % Tween 80, pH 7,4) est incubée dans des plaques à 96 puits dans un tampon GTPase (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05 % Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL leupeptine et 0,1 mM PMSF) et 0,3 mM GTP en présence du composé test pendant 30 min à 37 °C dans un volume d'essai final de 150 μL. Les réactions sont arrêtées avec 10 μL d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M pH 7,4 et une solution de Vert Malachite (40 μL : 2 % p/v tétrahydrate de molybdate d'ammonium, 0,15 % p/v vert malachite et 4 M HCl) est ajoutée pendant 5 min. Deuxièmement, la dynamine (20 nM) est stimulée par 10 µg/mL de microtubules préformés de cerveau bovin stabilisés au taxol en utilisant le même protocole. Troisièmement, la Dynamine I (50 nM) est stimulée par 1 μM de grb2 recombinant, une protéine contenant SH3 qui stimule la dynamine environ 5 à 10 fois moins efficacement que les liposomes ou les microtubules. Enfin, l'activité SAI de la dynamine (500 nM) est mesurée en utilisant des concentrations élevées de dynamine, qui favorisent son auto-assemblage coopératif en anneaux (mais pas en hélices). La concentration finale de DMSO dans les essais GTPase ou d'endocytose est d'au plus 3,3 ou 1 %, respectivement, mais typiquement de 1 %. L'essai GTPase pour la Dynamine I n'est pas affecté par le DMSO jusqu'à 3,3 %. Les composés sont dissous sous forme de stocks de 30 mM dans 100 % de DMSO. Ces solutions mères peuvent être stockées à –20 °C pendant plusieurs mois. Les composés sont ensuite dilués dans des solutions de 50 % de DMSO préparées dans 20 mM Tris–HCl pH 7,4 et dilués à nouveau dans l'essai final. Pour l'analyse de la cinétique de l'inhibition de ce composé, la Dynamine I à une concentration finale de 17 nM est incubée avec un tampon GTPase contenant du PS (2 µg/mL) et des quantités variables de GTP (50–250 μM) en présence de cette substance chimique à une concentration allant de 0,5 à 6 μM. La réaction est arrêtée après 30 min par addition d'EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Les courbes sont générées en utilisant l'équation de Michaelis–Menten v = Vmax[S]/(Km + [S]), où S est le substrat GTP. Après la détermination des valeurs Vmax et Km, les données ont été transformées en utilisant l'équation de Lineweaver–Burke, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Les conditions d'essai sont basées sur l'essai de la Dynamine I mais contenaient des modifications. La Dynamine II recombinante est utilisée à 50 nM, stimulée par 10 µg/mL de PS. La réaction GTPase est laissée se produire pendant 90 min à 37 °C avant l'arrêt.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.