GSK-J4 Hydrochloride

Le GSK J4 HCl est un dérivé éthylique de l'inhibiteur sélectif de l'histone déméthylase JMJD3, le GSK-J1, avec une valeur IC50 supérieure à 50 μM in vitro. Ce composé est utilisé pour sonder les conséquences de la déméthylation de H3K27me3. Dans les macrophages primaires humains, ce produit chimique inhibe la production de cytokines induite par le lipopolysaccharide, y compris le facteur de nécrose tumorale (TNF) pro-inflammatoire. De plus, il prévient la perte de H3K27me3 induite par le lipopolysaccharide associée aux sites de début de transcription du TNF et bloque le recrutement de l'ARN polymérase II. [1]

Le GSK-J4 hydrochloride est un puissant inhibiteur double des H3K27me3/me2-déméthylases JMJD3/KDM6B et UTX/KDM6A. Il inhibe la production de TNF-α induite par le LPS dans les macrophages primaires humains. Ce composé est une prodrogue perméable aux cellules du GSK-J1.

• AlphaScreen de la Histone Demethylase

  L'inhibition des histone déméthylases est évaluée à l'aide de l'essai AlphaScreen d'histone déméthylase (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay). Cet essai utilise un substrat peptidique biotinylé et repose sur la détection du marqueur méthyle du produit à l'aide d'un anticorps spécifique couplé à des billes accepteuses de protéine A et d'une bille donneuse de Streptavidine pour capturer le peptide. En bref, des enzymes déméthylases recombinantes sont incubées en présence de Fe2+ sous forme de sulfate ferreux d'ammonium (FAS), d'alpha-cétoglutarate (KG) et d'un substrat peptidique biotinylé. L'acide L-ascorbique est inclus pour fournir un environnement réducteur et prévenir l'oxydation du Fe2+. Après incubation avec le substrat peptidique, la présence du produit est détectée à l'aide de la technologie AlphaScreen. Les essais AlphaScreen de déméthylase sont réalisés dans des plaques de 384 puits en format proxiplates blanches. Toutes les étapes sont effectuées dans un tampon d'essai (50 mM HEPES pH 7,5, 0,1 % (p/v) BSA et 0,01 % (v/v) Tween-20). Le FAS est dissous frais chaque jour dans 20 mM HCl à une concentration de 400 mM et dilué à 1,0 mM dans de l'eau déionisée. Tous les autres composants sont dissous frais chaque jour dans de l'eau déionisée. Pour les déterminations d'IC50, 5 μL de tampon d'essai contenant l'enzyme déméthylase sont transférés dans les puits d'une proxiplate à 384 puits. Des titrations de ce composé (0,1 μL) sont transférées dans chaque puits et les enzymes sont laissées à pré-incuber pendant 15 minutes avec ce produit chimique (la concentration finale de DMSO est de 1 %). La réaction enzymatique est initiée par l'addition de 5 μL d'un mélange de substrats composé d'alpha-KG, de FAS, d'acide L-ascorbique et du substrat peptidique biotinylé, et la réaction est incubée pendant le temps indiqué à température ambiante. La réaction enzymatique est arrêtée après le temps indiqué par l'ajout de 5 μL d'EDTA (concentration finale de 7,5 mM dans le tampon d'essai). Des billes donneuses de Streptavidine (0,08 mg/ml) et des billes accepteuses conjuguées à la protéine A (0,08 mg/ml) sont pré-incubées pendant 1 heure avec un anticorps dirigé contre le marqueur méthyle du produit et la présence de biotine-H3-produit est détectée par l'ajout de 5 μL des billes AlphaScreen pré-incubées (concentrations finales de 0,02 mg/ml pour les billes accepteuses et donneuses). La détection est laissée à se dérouler pendant 1 heure à température ambiante et les plaques d'essai sont lues dans un lecteur de plaques BMG Labtech Pherastar FS. Les données sont normalisées par rapport au contrôle sans enzyme et l'IC50 est déterminée à partir de l'ajustement de la courbe de régression non linéaire à l'aide de GraphPad Prism 5.

• Lignées cellulaires

  Mouse podocytes

• Concentrations

  5 μM

• Temps dincubation

  48 h

• Méthode

  Cells were serum starved for 4 hours, followed by treatment with EPZ-6438 (10 μM) or this compound (5 μM) for 48 hours.

• Modèles animaux

  BALB/c mice

• Posologies

  10 mg/kg

• Administration

  i.p.