GSK126

Le complexe PRC2 à cinq membres (Flag–EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48) contenant soit l'EZH2 de type sauvage, soit l'EZH2 mutante est préparé. GSK126 est dissous dans le DMSO et testé à des concentrations de 0,6 nM à 300 nM avec une concentration finale de DMSO de 2,5 %. Contrairement à l'EZH2 de type sauvage qui préfère H3K27me0 comme substrat in vitro, les mutants Y641 d'EZH2 préfèrent H3K27me2 et ont peu d'activité avec H3K27me0 ou H3K27me1. Le mutant A677G est distinct des formes sauvage et mutantes Y641 d'EZH2 en ce qu'il méthyle efficacement H3K27me0, H3K27me1 et H3K27me2 ; par conséquent, des peptides d'histone H3 (résidus 21–44 ; 10 μM final) avec K27me0 (type sauvage, A677G EZH2), K27me1 (A677G EZH2) ou K27me2 (A677G, Y641N, Y641C, Y641H, Y641S et Y641F EZH2) sont utilisés comme substrats de méthyltransférase. Ce composé est ajouté aux plaques, suivi de l'ajout de 6 nM de complexe EZH2 et de peptide. Comme la puissance de ce produit chimique est proche ou égale à la limite de liaison étroite d'un essai réalisé à [SAM] = Km, les valeurs d'IC50 sont mesurées à une concentration élevée du substrat compétitif SAM par rapport à son Km (7,5 μM SAM, le Km du SAM étant de 0,3 μM). Dans ces conditions, la contribution de la concentration enzymatique devient relativement faible et des estimations précises de Ki peuvent être calculées. Les réactions sont initiées avec [³H]-SAM, incubées pendant 30 min, stoppées par l'ajout d'un excès 500 fois supérieur de SAM non marqué, et le peptide produit méthylé est capturé sur des filtres de phosphocellulose selon le protocole fourni par le fournisseur pour les plaques MSPH Multiscreen. Les plaques sont lues sur un TopCount après l'ajout de 20 μL de cocktail Microscint-20. Les valeurs apparentes de Ki sont calculées en utilisant la relation de Cheng–Prusoff pour un inhibiteur compétitif. IC50=Ki (1+[S]/Km)+[E]/2, où E est l'enzyme et S est le substrat.

46 lymphoma cell lines

0~10 μM

6 days

The optimal cell seeding is determined empirically for all cell lines by examining the growth of a wide range of seeding densities in a 384-well format to identify conditions that permitted proliferation for 6 days. Cells are then plated at the optimal seeding density 24 h before treatment (in duplicate) with a 20-point two fold dilution series of GSK126 or 0.15% DMSO. Plates are incubated for 6 days at 37°C in 5% CO₂. Cells are then lysed with CellTiter-Glo (CTG) and chemiluminescent signal is detected with a TECAN Safire2 microplate reader. In addition, an untreated plate of cells is harvested at the time of compound addition (T0) to quantify the starting number of cells. CTG values obtained after the 6 day treatment are expressed as a percent of the T0 value and plotted against this compound concentration. Data are fit with a four-parameter equation to generate a concentration response curve and the concentration of this chemical required to inhibit 50% of growth (growth IC50) is determined.

Female beige SCID mice bearing Pfeiffer or KARPAS-422 tumors

150 mg/kg/day

i.p.