GSK2606414

Ce composé inhibe l'autophosphorylation de PERK dans les cellules A459 avec une IC50 de <0,3 μM. [1]

Le GSK2606414 présente une biodisponibilité orale élevée et une clairance sanguine faible à modérée chez la souris, le rat et le chien. Ce composé, administré par voie orale, inhibe la croissance tumorale de manière dose-dépendante chez des souris porteuses de tumeurs pancréatiques humaines BxPC3. [1]

• Dosage de la Kinase du Réticulum Endoplasmique de type PKR (PERK) (Format HTRF)

  Le domaine cytoplasmique de GST-PERK est acheté. L'eIF2α humain pleine longueur 6-His est purifié à partir d'une expression par baculovirus dans des cellules d'insectes Sf9. La protéine eIF2α est échangée par dialyse dans du PBS, modifiée chimiquement par NHS-LC-biotine puis échangée par dialyse dans 50 mM Tris, pH 7,2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT. La protéine est aliquote et stockée à -80 °C. La solution de quenching est fraîchement préparée et, lorsqu'elle est ajoutée à la réaction, donne des concentrations finales de 4 nM d'anticorps eIF2α phospho-ser51, 4 nM d'IgG anti-lapin marqué Eu-1024, 40 nM de streptavidine Surelight APC et 15 mM d'EDTA. Les réactions ont été réalisées dans des plaques noires à 384 puits en polystyrène à faible volume dans un volume final de 10 μL. Le volume de réaction contient, en concentrations finales, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 5 μM ATP, 1 mM DTT, 2 mM CHAPS, 40 nM d'eIF2α 6-His biotinylé et 0,4 nM de GST-PERK. Les composés sous analyse sont dissous dans du DMSO à 1,0 mM et dilués en série 1-3 avec du DMSO à travers 11 dilutions. Une quantité de 0,1 μL de chaque concentration est transférée dans le puits correspondant d'une plaque d'essai. Cela crée une gamme de concentrations finales de composé de 0,00017 à 10 μM. La solution de GST-PERK est ajoutée aux plaques d'essai contenant les composés et pré-incubée pendant 30 min à température ambiante. La réaction est initiée par l'ajout d'ATP et de solution de substrat eIF2α. Après 1 h d'incubation, la solution de quenching est ajoutée. Les plaques sont couvertes pendant 2 h à température ambiante avant la détermination du signal. Le signal résultant est quantifié sur un lecteur Viewlux. Le signal APC est normalisé au signal europium en transformant les données par un calcul APC/Eu. Les données pour les courbes de réponse à la concentration sont tracées en % d'inhibition calculé avec la formule de réduction des données 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)] par rapport à la concentration du composé où U est la valeur inconnue, C1 est la valeur de contrôle moyenne obtenue pour 1% de DMSO et C2 est la valeur de contrôle moyenne obtenue pour 0,1 M d'EDTA. Les données sont ajustées avec une courbe décrite par où A est la réponse minimale, B est la réponse maximale, D est le facteur de pente, x est la concentration du composé et C est l'IC50. Les résultats pour chaque composé sont enregistrés comme valeurs d'IC50.

• Lignées cellulaires

  A549 cells

• Concentrations

  0.3 μM

• Temps dincubation

  2 h

• Méthode

  Cells were incubated with PERK inhibitor (GSK2606414, compound 38) and then stimulated with thapsigargin. After 2 h, the cells were lysed and analyzed for inhibition of PERK autophosphorylation.

• Modèles animaux

  BxPC3 human pancreatic xenograft model

• Posologies

  ~150 mg/kg

• Administration

  Oral administration