GSK343

GSK343 inhibe la triméthylation de H3K27 (H3K27me3) avec une IC50 de 174 nM dans les cellules de cancer du sein HCC1806. Ce composé inhibe puissamment la prolifération cellulaire dans les cellules de cancer du sein et les cellules de cancer de la prostate, et la lignée cellulaire de cancer de la prostate LNCaP est la plus sensible à celui-ci, avec une IC50 de 2,9 μM. [1]

Cette substance chimique supprime significativement la croissance des cellules EOC cultivées dans une matrice extracellulaire (ECM) de matrigel 3D, qui imite le microenvironnement tumoral in vivo. De plus, elle induit également l'apoptose des cellules EOC en 3D et inhibe significativement l'invasion des cellules EOC. [2]

GSK343, un inhibiteur sélectif de EZH2, inhibe la phagocytose.

• Essais biochimiques in vitro contre Histone Methyltransferase

  L'activité contre EZH2 est évaluée en utilisant un complexe PRC2 à 5 membres (Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48). Le protocole d'essai peut être résumé comme suit : des stocks de 10 mM de composés sont préparés à partir de solides dans 100% de DMSO. Une plaque mère de dilution sérielle à 11 points est préparée au format 384 puits (dilution 1:3, les colonnes 6 et 18 étaient des contrôles DMSO de volume égal) et distribuée sur des plaques prêtes pour l'essai à l'aide d'une technologie de distribution acoustique pour créer une empreinte de 100 nL de composé et de contrôles DMSO. Les ajouts d'essai consistaient en des ajouts de volume égal de 10 nM EZH2 et de la solution de substrat (5 Tµg/mL de nucléosomes HeLa et 0,25 TµM de [³H]-SAM) distribués dans les plaques d'essai à l'aide d'un distributeur multi-gouttes. Les plaques de réaction sont incubées pendant 1 heure et éteintes avec un ajout de volume égal de 0,5 mg/mL de billes d'imagerie PS-PEI (RPNQ0098) contenant 0,1 mM de SAM non marqué. Les plaques sont scellées, adaptées à l'obscurité pendant 30 minutes, et une image de luminescence de point final de 5 minutes est acquise à l'aide d'un imageur Viewlux. Les statistiques de plaque telles que Z' et le rapport signal/bruit ainsi que les courbes dose-réponse sont analysées à l'aide d'Activity BaseXE. L'activité biochimique in vitro d'EZH1 est évaluée dans le cadre d'un complexe PRC2 à 5 membres à l'aide d'un essai SPA à 384 puits identique à EZH2. Les composants du tampon, la distribution des réactifs, la préparation des plaques de composés, les conditions d'extinction et l'analyse des données sont identiques pour EZH1 et EZH2 avec des concentrations finales d'essai de 20 nM EZH1, 5 TµM/mL de nucléosomes HeLa et 0,25 TµM de [³H]-SAM. Une analyse de données supplémentaire, des pivots pIC50 et des visualisations sont activés par TIBCO Spotfire. Ce composé est profilé chez Reaction Biology Corp. (Malvern, PA) pour évaluer l'inhibition dans leur panel d'essais de Histone Methyltransferase. L'activité de la méthyltransférase est évaluée à l'aide de la technologie HotSpot, un essai de liaison par filtre basé sur un radio-isotope miniaturisé. Les inhibiteurs sont dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et testés à des concentrations allant jusqu'à 100 uM avec une concentration finale de DMSO de 2 %. Le tampon contenant la méthyltransférase à la concentration indiquée et son substrat préféré, comme indiqué dans le tableau ci-joint, est pré-incubé avec ce produit chimique pendant 10 minutes. Les réactions sont initiées par l'ajout de 1 uM de S-adénosyl-L-[méthyl-³H]méthionine (SAM), laissées incuber pendant 60 minutes à 30 °C, puis transférées sur du papier filtre P81 et lavées avec du PBS avant détection.

• Lignées cellulaires

  Breast cancer cell lines (HCC1806, Sk-Br-3, ZR-75-1), prostate cancer cell lines (DU145, PC3, LNCaP)

• Concentrations

  ~50 μM

• Temps dincubation

  6 days

• Méthode

  To account for varying doubling rates among cancer cell lines, the optimal cell seeding is determined empirically for all cell lines by examining their growth in a 384-well plate over 6 days with a wide range of seeding densities. Cells are then plated at the optimal seeding density and allowed to adhere overnight. Cells are treated in duplicate with a 20-point 2-fold dilution series of this compound or 0.147% DMSO (vehicle control) and incubated for 6 days at 37C in 5% CO2. Cells are then lysed with 25 μl CellTiter-Glo per well and chemiluminescence is quantified with a TECAN Safire2 microplate reader. In addition, an untreated plate of cells is harvested at the time of compound addition (T0) to quantify the starting number of cells. CTG values after 6 days of treatment were expressed as a percent of the T0 value and plotted against compound concentration. Data are fit with a 4-parameter equation to generate a concentration response curve and the concentration of compound required to inhibit 50% of growth (gIC50) is determined