Fiche technique

Description biologique

Spécificité	HDAC4 Antibody [J11H24] reconnaît les niveaux endogènes de la protéine HDAC4 totale.
Contexte	L'acétylation et la désacétylation des histones sont cruciales pour la régulation de la transcription génique. L'acétylation des histones, médiée par les histones acétyltransférases (HATs), relâche la structure de la chromatine et améliore l'activation transcriptionnelle. Inversement, la désacétylation des histones, réalisée par les histones désacétylases (HDACs), conduit à la condensation de la chromatine et à la répression transcriptionnelle. Les HDACs sont classées en trois catégories — I, II et III — en fonction de leur taille, de leur homologie de séquence et de la formation de complexes. Parmi les HDACs de classe II, HDAC4 joue un rôle significatif dans la régulation de l'expression génique essentielle à diverses fonctions cellulaires. HDAC4 présente un domaine régulateur N-terminal unique qui interagit avec des facteurs de transcription spécifiques et un domaine catalytique C-terminal contenant du zinc. L'analyse par cristallographie a montré qu'un domaine de liaison au zinc correctement replié est crucial pour la formation du complexe répresseur. Les modifications post-traductionnelles de HDAC4 affectent sa localisation subcellulaire et ses interactions avec d'autres protéines. Une fonction clé de HDAC4 est de médier la répression transcriptionnelle en régulant la condensation et la structure de la chromatine. Les modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation réversible, sont vitales pour les fonctions régulatrices de HDAC4. HDAC4 interagit avec la famille des protéines 14-3-3, qui se lient spécifiquement aux motifs contenant de la phosphosérine. HDAC4 peut être phosphorylée par diverses kinases, y compris la protéine kinase dépendante du calcium/calmoduline (CaMK), les kinases régulées par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), la protéine kinase A (PKA) et la glycogène synthase kinase 3 (GSK3). Par son rôle dans la régulation de la transcription génique, de la croissance, de la survie et de la prolifération cellulaires, une dérégulation ou une activité anormale de HDAC4 peut contribuer au développement du cancer.

Spécificité

HDAC4 Antibody [J11H24] reconnaît les niveaux endogènes de la protéine HDAC4 totale.

Contexte

L'acétylation et la désacétylation des histones sont cruciales pour la régulation de la transcription génique. L'acétylation des histones, médiée par les histones acétyltransférases (HATs), relâche la structure de la chromatine et améliore l'activation transcriptionnelle. Inversement, la désacétylation des histones, réalisée par les histones désacétylases (HDACs), conduit à la condensation de la chromatine et à la répression transcriptionnelle. Les HDACs sont classées en trois catégories — I, II et III — en fonction de leur taille, de leur homologie de séquence et de la formation de complexes. Parmi les HDACs de classe II, HDAC4 joue un rôle significatif dans la régulation de l'expression génique essentielle à diverses fonctions cellulaires. HDAC4 présente un domaine régulateur N-terminal unique qui interagit avec des facteurs de transcription spécifiques et un domaine catalytique C-terminal contenant du zinc. L'analyse par cristallographie a montré qu'un domaine de liaison au zinc correctement replié est crucial pour la formation du complexe répresseur. Les modifications post-traductionnelles de HDAC4 affectent sa localisation subcellulaire et ses interactions avec d'autres protéines. Une fonction clé de HDAC4 est de médier la répression transcriptionnelle en régulant la condensation et la structure de la chromatine. Les modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation réversible, sont vitales pour les fonctions régulatrices de HDAC4. HDAC4 interagit avec la famille des protéines 14-3-3, qui se lient spécifiquement aux motifs contenant de la phosphosérine. HDAC4 peut être phosphorylée par diverses kinases, y compris la protéine kinase dépendante du calcium/calmoduline (CaMK), les kinases régulées par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), la protéine kinase A (PKA) et la glycogène synthase kinase 3 (GSK3). Par son rôle dans la régulation de la transcription génique, de la croissance, de la survie et de la prolifération cellulaires, une dérégulation ou une activité anormale de HDAC4 peut contribuer au développement du cancer.

Informations dutilisation

Application

WB, IP

Dilution

WB	IP
1:2000	1:100

Réactivité

Human, Mouse, Rat, Monkey

Source

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

140 kda

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

Stockage
(À partir de la date de réception)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:2000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 709. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:2000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

709. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24579951/

Données dapplication

WB

Validé par Selleck

Lane 1: 293
Lane 2: Hela
Lane 3: H-4-II-E