IOX1

IOX1 augmente les niveaux de H3K9me3 dans les cellules HeLa via l'inhibition de KDM4A sans effet significatif sur la viabilité cellulaire. Ce composé montre une efficacité plus faible dans les cellules HeLa en raison de sa faible perméabilité cellulaire, tandis que le dérivé n-octyl ester améliore sa perméabilité cellulaire. [1]

• Essai AlphaScreen

  Tous les réactifs sont dilués dans 50 mM HEPES, 0,1 % BSA, pH 7,5 supplémenté avec 0,01 % Tween20 et laissés s'équilibrer à température ambiante avant d'être ajoutés aux plaques. Les essais de renouvellement catalytique sont réalisés dans des volumes de 10 μL dans des plaques 384 puits à faible volume à TA. La réaction consistait en une enzyme (5 nM), un peptide substrat biotinylé (30 nM), du Fe(II) (1 μM), de l'ascorbate (100 μM), du 2OG (10 μM) et s'est déroulée à TA. Pour le PHD2, la réaction consistait en une enzyme (5 nM), un peptide substrat biotinylé (60 nM), du Fe(II) (20 μM), de l'ascorbate (200 μM), du 2OG (2 μM) et s'est déroulée à TA. L'EDTA est utilisé pour éteindre la réaction (5 μL), des billes AlphaScreen donneuses (conjuguées à la streptavidine) et accepteuses (conjuguées à la protéine A) préincubées avec des anticorps de produit peptidique sont ajoutées (5 μL). Les plaques sont scellées avec une feuille pour protéger de la lumière, incubées à température ambiante pendant 60 minutes et lues sur un lecteur de plaques PHERAstar FS utilisant un ensemble de filtres AlphaScreen 680 excitation/570 émission. La concentration finale de billes dans la réaction de 20 μL est de 20 μg/mL. Les valeurs IC50 sont calculées dans Prism 6 après normalisation par rapport aux contrôles DMSO correspondants.

• Lignées cellulaires

  HeLa cells

• Concentrations

  ~300 μ M

• Temps dincubation

  24 hours

• Méthode

  Antiproliferative activities of compounds are determined by the MTT assay. HeLa cells are seeded into 96-well plates and cultured at 37 °C for 24 h to achieve 70%. Subsequently, the medium is replaced with DMEM medium containing the tested compounds in different concentrations of 1-300 μM in 1% DMSO. Staurosporine in 0.03-10 μM final concentration is used as a control for cytotoxicity. After 24 h of treatment, the medium is replaced with CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent and incubated for 4 hours. CC50 values are calculated in Prism 6 software after normalisation against corresponding 1% DMSO treated cells and 1% DMSO in media (no cells) controls.