LDN-214117

Les protéines ALK2 recombinantes purifiées, l'ATP, l'ATP[γ-³²P] et la caséine déphosphorylée à des concentrations finales de 2,5 nM, 6 μM, 0,05 μCi/μL et 0,5 mg/mL, respectivement, sont aliquotes dans un tampon de kinase contenant 0,2 % de BSA supplémenté avec 10 mM de MnCl₂ dans des plaques de microtitration à 96 puits, en combinaison avec des composés inhibiteurs dilués à diverses concentrations (0,01 nM à 100 μM). Des échantillons de contrôle positif dépourvus de ce composé, et des contrôles négatifs dépourvus de kinase recombinante, sont également mesurés. Le mélange est mis à réagir à température ambiante pendant 45 min, puis stoppé avec une concentration finale de 2 % d'acide phosphorique. Le mélange réactionnel est transféré dans des plaques de filtration en phosphocellulose P81 à 96 puits et lié pendant 5 min. Les plaques sont lavées 20 fois avec 150 μL de solution d'acide phosphorique à 1 % par puits à l'aide d'un manifold à vide. Les plaques sont séchées à température ambiante pendant 1 h, scellées et analysées avec le liquide de scintillation Microscint 20 à l'aide d'un luminomètre Spectramax L. Les données sont normalisées par rapport aux contrôles positifs à 100 % d'activité enzymatique, les contrôles négatifs étant soustraits comme bruit de fond.

HepG2 hepatocarcinoma cells

100 μM

24 h

Cells are seeded at 25000 cells per well in 96-well plates and incubated for 2 h at 37℃ and 5% CO₂. Compounds of LDN-214117 or DMSO are diluted in DMEM and added at final compound concentrations of 1, 10, and 100 μM. Cells are incubated for 4 and 24 h, after which the media is discarded. Cells are lysed by adding 30 μL of passive lysis buffer and shaken at RT for 15 min. Cell viability is determined by quantifying the ATP present in each well by adding 10 μL of Cell Titer Glo per well and measuring the light output by Spectramax L luminometer. Data is normalized to 100% viability for cells receiving only DMSO.