Fiche technique

Description biologique

Spécificité	Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3] détecte les niveaux endogènes de la protéine totale Na+/H+ Exchanger-1.
Contexte	Na+/H+ Exchanger-1 (NHE1, SLC9A1) est un antiporteur membranaire intégral exprimé de manière ubiquitaire qui joue un rôle central dans la régulation de l'homéostasie du pH intracellulaire (pHi). NHE1 est composé de 12 hélices transmembranaires (TMHs) avec les N- et C-terminaisons faisant face au cytosol. Les segments de transport clés incluent les TM IV, VII et IX, ainsi que les boucles réentrantes IL2 et IL4, et les sites de glycosylation sur la boucle extracellulaire 5 (EL5) qui confèrent une stabilité structurelle. Le domaine cytoplasmique C-terminal étendu d'environ 315 résidus contient de nombreux sites de phosphorylation sérine/thréonine et des motifs de liaison à l'ezrine (résidus 553–564), ancrant NHE1 au cytosquelette d'actine. NHE1 est activé allostériquement par l'acidification intracellulaire, ce qui favorise la liaison des protons à un site modificateur non-transport (coefficient de Hill ~3), déclenchant des changements conformationnels des états orientés vers l'intérieur vers les états orientés vers l'extérieur par inclinaison des hélices et des voies d'accès remplies d'eau, similaires au transporteur bactérien NhaA. Il assure l'échange électrogénique de Na+ extracellulaire (Km 5–50 mM) contre H+ intracellulaire selon une stœchiométrie de 1:1, utilisant le gradient transmembranaire de Na+ comme force motrice sans apport énergétique direct. Cela permet une récupération rapide du pHi après une acidose, la régulation du volume cellulaire via l'influx de Na+, et l'échafaudage de la protrusion des lamellipodes par des interactions ERM-actine. La signalisation hormonale et des facteurs de croissance peut phosphoryler les sérines C-terminales (par exemple, S703, Thr653) via les voies NHERF1, ERK et PKA, déplaçant le point de consigne du pHi vers l'alcalinité. Pathologiquement, lors d'une lésion d'ischémie-reperfusion, NHE1 activé par l'acide favorise une surcharge cytotoxique de Na+/Ca2+ via l'activité NCX en mode inverse, exacerbant l'infarctus du myocarde. La régulation positive chronique de NHE1 est également impliquée dans l'invasion tumorale par alcalinisation péricellulaire et remodelage de la matrice, ainsi que dans l'hypertrophie cardiaque.

Spécificité

Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3] détecte les niveaux endogènes de la protéine totale Na+/H+ Exchanger-1.

Contexte

Na+/H+ Exchanger-1 (NHE1, SLC9A1) est un antiporteur membranaire intégral exprimé de manière ubiquitaire qui joue un rôle central dans la régulation de l'homéostasie du pH intracellulaire (pHi). NHE1 est composé de 12 hélices transmembranaires (TMHs) avec les N- et C-terminaisons faisant face au cytosol. Les segments de transport clés incluent les TM IV, VII et IX, ainsi que les boucles réentrantes IL2 et IL4, et les sites de glycosylation sur la boucle extracellulaire 5 (EL5) qui confèrent une stabilité structurelle. Le domaine cytoplasmique C-terminal étendu d'environ 315 résidus contient de nombreux sites de phosphorylation sérine/thréonine et des motifs de liaison à l'ezrine (résidus 553–564), ancrant NHE1 au cytosquelette d'actine. NHE1 est activé allostériquement par l'acidification intracellulaire, ce qui favorise la liaison des protons à un site modificateur non-transport (coefficient de Hill ~3), déclenchant des changements conformationnels des états orientés vers l'intérieur vers les états orientés vers l'extérieur par inclinaison des hélices et des voies d'accès remplies d'eau, similaires au transporteur bactérien NhaA. Il assure l'échange électrogénique de Na+ extracellulaire (Km 5–50 mM) contre H+ intracellulaire selon une stœchiométrie de 1:1, utilisant le gradient transmembranaire de Na+ comme force motrice sans apport énergétique direct. Cela permet une récupération rapide du pHi après une acidose, la régulation du volume cellulaire via l'influx de Na+, et l'échafaudage de la protrusion des lamellipodes par des interactions ERM-actine. La signalisation hormonale et des facteurs de croissance peut phosphoryler les sérines C-terminales (par exemple, S703, Thr653) via les voies NHERF1, ERK et PKA, déplaçant le point de consigne du pHi vers l'alcalinité. Pathologiquement, lors d'une lésion d'ischémie-reperfusion, NHE1 activé par l'acide favorise une surcharge cytotoxique de Na+/Ca2+ via l'activité NCX en mode inverse, exacerbant l'infarctus du myocarde. La régulation positive chronique de NHE1 est également impliquée dans l'invasion tumorale par alcalinisation péricellulaire et remodelage de la matrice, ainsi que dans l'hypertrophie cardiaque.

Informations dutilisation

Application

WB

Dilution

WB

1:500

Réactivité

Mouse, Human, Amphibian, Fish, Avian, Vertebrates

Source

Mouse Monoclonal Antibody

MW

~100-110 kDa

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Stockage
(À partir de la date de réception)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:500), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:500), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34108458/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33273619/

Données dapplication

WB

Validé par Selleck

Lane 1: U87MG, Lane 2: THP-1, Lane 3: 22RV1, Lane 4: Mouse brain