NMS-873

L'activité ATPase et les paramètres cinétiques de la VCP de type sauvage recombinante et de ses mutants sont évalués en surveillant la formation d'ADP dans la réaction, à l'aide d'un essai couplé au NADH modifié. Étant donné que l'ADP et le NADH sont des inhibiteurs compétitifs de l'ATP de l'activité ATPase de la VCP, le protocole standard de l'essai couplé au NADH est modifié en une procédure en deux étapes. Dans la première partie, un système de régénération d'ATP (40 U/ml de pyruvate kinase et 3 mM de phosphoénolpyruvate) recycle l'ADP produit par l'activité de la VCP, maintient la concentration du substrat constante (empêchant ainsi l'inhibition du produit) et accumule une quantité stœchiométrique de pyruvate. Dans la deuxième partie, la réaction enzymatique de la VCP est arrêtée avec 30 mM d'EDTA et 250 μM de NADH et oxydée stœchiométriquement par 40 U/ml de lactate déshydrogénase pour réduire le pyruvate accumulé. La diminution de la concentration de NADH est mesurée à 340 nm à l'aide d'un lecteur de plaque Tecan Safire 2. L'essai est réalisé dans des plaques UV à 96 ou 384 puits dans un tampon de réaction contenant 50 mM d'Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/mL de BSA, 10 mM de MgCl₂ et 2 mM de DTT. Les données expérimentales sont ajustées avec une équation coopérative obtenant un Ks* d'environ 60 μM et un coefficient de Hill (n) de 2,0 ± 0,1. La campagne HTS est réalisée contre une bibliothèque de 1 million de composés à l'aide d'un essai miniaturisé au format 1 536 puits et d'un système de détection d'ADP plus sensible, Transcreener ADP FP. Une préincubation de 20 minutes de 10 nM de VCP et de 10 μM d'inhibiteur est effectuée, après quoi 10 μM d'ATP sont ajoutés à la réaction, qui est laissée à se dérouler pendant 90 minutes avant d'être arrêtée. Le Z' moyen du criblage est de 0,58, et le taux de succès utilisant 3× s.d. (38 % d'inhibition) comme seuil est de 1,7 %. Les hits primaires avec >60 % d'inhibition à une concentration de 10 μM sont élagués à l'aide de filtres physico-chimiques et structurels pour ne laisser que 7 516 composés. Au final, une reconfirmation est effectuée en double sur 3 988 hits primaires, et 500 composés sont sélectionnés pour une évaluation dose-réponse à l'aide de l'essai couplé modifié au NADH décrit précédemment. La puissance des hits HTS les plus intéressants est mesurée à la fois contre la VCP de type sauvage et le mutant C522T. Les concentrations d'ATP qui ont donné la vitesse semi-maximale (Ks*) pour chaque enzyme, correspondant à 60 μM et 130 μM pour le type sauvage et le mutant C522T, respectivement, sont utilisées dans l'essai. Pour explorer la dépendance des inhibiteurs réversibles de la concentration du substrat, leur puissance est également évaluée à une concentration d'ATP saturante (1 mM) et comparée à la puissance d'un inhibiteur compétitif standard de l'ATP (AMP-PNP).

A variety of hematological and solid tumor lines

~10 μM

72 hours

Cells are seeded at 1,600 cells per well in 384-well white clear-bottom plates. Twenty-four hours after seeding, cells are treated with the compounds (eight dilution points, in duplicate, for each compound) and incubated for an additional 72 h at 37 °C under a 5% CO₂ atmosphere. Cells are then lysed, and the ATP content in each well is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay as a measure of cell viability. IC50 values are calculated using the percentage of growth of treated cells versus the untreated control.