NVP-BSK805 2HCl

Le domaine kinase humain JAK2 (acides aminés 840-1132) est contenu dans le construit plasmidique pAcG2TtevJAK2. Les construits plasmidiques pour JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) et JAK1 (866-1154) sont conçus. La génération des baculovirus recombinants avec de l'ADN linéarisé BD BaculoGold^TM Bright, l'essai de plages et l'amplification du virus à partir de plages uniques sont réalisés selon le manuel (BD Biosciences Pharmingen). Les domaines de la kinase Janus sont exprimés dans des cellules Sf9 dans des fioles d'agitation de 400 mL avec 100 mL de milieu de culture ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) avec une solution de pénicilline/streptomycine pendant 48 h à 27 °C. Les cellules en culture en suspension sont infectées à une densité de 1 × 10⁶ et la multiplicité d'infection (MOI) pour chaque virus est optimisée pour le rendement en protéine soluble. Le domaine kinase de la JAK2 humaine et de JAK1, JAK3 et TYK2 est exprimé à un MOI de 1 et 0,5, respectivement. Le temps d'expression à 27 °C est de 48 heures pour JAK2 et de 48 heures ou 72 heures pour JAK1, JAK3 et TYK2. Quarante-huit ou soixante-douze heures après l'infection, les cellules d'une culture d'expression de 100 mL sont récoltées par centrifugation à 3000 x g pendant 5 minutes et lysées avec 12 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM orthovanadate de sodium, 1 % Triton X-100, 10 % glycérol, 1 x cocktail inhibiteur de protéase complet sans EDTA (Roche Diagnostics) et 12,5 U/mL Benzonase pendant 30 minutes à 4 °C, suivi d'une centrifugation à 14 000 × g pendant 45 minutes pour pélletter le matériel insoluble. Pour la purification par affinité par étiquette GST des protéines du domaine kinase, toutes les étapes sont effectuées à 4 °C. Les lysats clarifiés sont incubés avec 0,2 mL d'une suspension à 50 % de Glutathione Sepharose 4B lavée pendant 2 heures à 4 °C, suivi de 5 lavages avec 1 mL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT et 10 % glycérol. La protéine liée est éluée en 5 aliquotes, chacune commençant par une incubation de 10 minutes avec 0,25 mL de tampon d'élution (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glycérol, 10 mM L-glutathion réduit). Les éluats sont concentrés environ 5 fois avec des colonnes de centrifugation Amicon Ultra-4. Après addition de Brij35 à une concentration finale de 0,1 %, la protéine est congelée rapidement en petits aliquots et stockée à -80 °C. Dans ces conditions, les activités kinases sont stables pendant au moins 6 mois. Les enzymes du domaine kinase JAK sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans un milieu contenant 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM de substrat peptidique synthétique EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 et 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentration d'ATP est inférieure au Km pour toutes les protéines. Les courbes sont ajustées par régression non linéaire à l'aide de l'équation logistique et de la fonction d'ajustement global de XLfit® (modèle 205). L'expression et la caractérisation de JAK2 de type sauvage et mutant V617F pleine longueur ainsi que les conditions d'essai kinase ont été décrites ailleurs. La sélectivité kinase de NVP-BSK805 est évaluée dans un panel interne de kinases : Dans les essais Caliper, les réactions kinases sont effectuées avec des substrats peptidiques qui migrent à des vitesses différentes dans un champ électrique lorsqu'ils sont phosphorylés. Les peptides portent un marqueur fluorescent afin de permettre la détection et la quantification des peptides dans un système capillaire. Les intensités de fluorescence des peptides sont quantifiées à l'aide de l'instrument LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). L'activité kinase est mesurée en quantifiant la quantité d'ATP restant en solution après une réaction kinase. Dans les essais kinases LanthaScreen™ TR-FRET, le terbium est utilisé comme chélate de lanthanide combiné à un anticorps dirigé contre le substrat phosphorylé.

Ba/F3 cells

100 nM

72 hours

The anti-proliferative activity of JAK2 inhibitors is determined by incubating cells for 72 hours with an 8-point concentration range of compound and cell proliferation relative to DMSO-treated cells is measured using the colorimetric WST-1 (Roche Diagnostics GmbH) cell viability readout. Of each triplicate treatment, the mean is calculated and these data are plotted in XLfit 4 (ID Business Solutions, Ltd.) to determine the half-maximal growth inhibition (GI50) values.

RhEpo-induced polycythemia model in Female BALB/c mice

50, 75, and 100 mg/kg

Once daily oral administration