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In vivo (Ajouter les solvants au produit individuellement et dans lordre.)
Homogeneous suspension
CMC-NA
≥5mg/ml
Taking the 1 mL working solution as an example, add 5 mg of this product to 1 ml of CMC-Na solution, mix evenly to obtain a homogeneous suspension with a final concentration of 5 mg/ml.
Clear solution
Saline
Validé par les laboratoires Selleck. Si vous avez besoin dajustements à cette formulation, contactez notre équipe commerciale pour des tests personnalisés.
30.000mg/ml
(68.66mM)
Taking the 1 mL working solution as an example, add 30 mg of this product to 1 ml of physiological saline (0.9% NaCL solution), mix evenly to make it clear, The mixed solution should be used immediately for optimal results.
* <1 mg/ml signifie légèrement soluble ou insoluble. * Veuillez noter que Selleck teste la solubilité de tous les composés en interne, et la solubilité réelle peut différer légèrement des valeurs publiées. Ceci est normal et est dû à de légères variations dun lot à lautre. * Expédition à température ambiante (les tests de stabilité montrent que ce produit peut être expédié sans aucune mesure de refroidissement.)
Préparation des solutions mères
Activité biologique
Description
PF-5274857 est un antagoniste puissant et sélectif de la Smoothened (Smo), inhibe la signalisation Hedgehog (Hh) avec des IC50 et Ki de 5,8 nM et 4,6 nM, respectivement, et ce composé peut pénétrer la barrière hémato-encéphalique.
Cibles
Smoothened
Smoothened
4.6 nM(Ki)
5.8 nM
In vitro
PF-5274857 inhibe complètement l'activité de la voie Hh induite par Shh avec un IC50 de 2,7 nM mesuré par l'activité transcriptionnelle du gène en aval de Smo, Gli1, dans les cellules MEF. Le récepteur μ-opioïde est faiblement inhibé par ce composé avec une constante de dissociation de 36 μM déterminée ultérieurement dans un essai fonctionnel.
In vivo
PF-5274857 montre une inhibition significative de la croissance tumorale (TGI) dépendante de la dose et induit une régression tumorale à fortes doses (>10 mg/kg). Ce composé régule à la baisse les niveaux d'expression des gènes Gli1, Gli2, Ptch1 et Ptch2 à des degrés divers, les effets maximaux étant atteints entre 6 et 12 heures après l'administration (Gli1 étant le gène le plus sensible), tandis qu'il a peu d'effet sur les niveaux de Smo. Dans le tissu cutané, une régulation à la baisse de Gli1 et Gli2 est également observée avec une cinétique similaire par ce produit chimique. La concentration médicamenteuse dérivée du modèle pour l'inhibition semi-maximale du taux de production d'ARNm de Gli1 tumoral (IC50) par ce composé est déterminée à 8,9 nM chez les souris allogreffées de médulloblastome Ptch+/−p53+/−, ce qui correspond mathématiquement à une régression tumorale de 119 % TGI après 6 jours d'exposition plasmatique à cette concentration. Chez les souris allogreffées de médulloblastome Ptch+/−p53−/−, la valeur de l'IC50 est estimée à 3,5 nM, ce qui est cohérent avec les résultats Ptch+/−p53+/−. Il est également capable de traverser la barrière hémato-encéphalique chez les rats dans les 4 heures suivant l'administration.
Les cellules HEK293 surexprimant la Smo humaine (acides aminés 181-787) sont cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS, Pen-Strep et 0,1 mg/mL d'hygromycine jusqu'à 90% de confluence. Après lavage avec du PBS de Dulbecco froid, le culot cellulaire est resuspendu dans un tampon de préparation membranaire (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM saccharose avec le cocktail de protéase complet de Roche) et homogénéisé. L'homogénat est centrifugé et le culot cellulaire est resuspendu dans un tampon d'essai (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA et 0,1 % d'albumine sérique bovine sans protéase) et homogénéisé dans un broyeur de tissus en verre. La protéine totale dans la préparation membranaire contenant Smo est déterminée à l'aide de l'essai protéique Pierce BCA. Pour l'essai de liaison compétitive, 100 μL de tampon d'essai sont ajoutés à une plaque filtrante GF/B à 96 puits pendant 10 minutes pour pré-humidifier le filtre, puis retirés. Les réactifs suivants sont ensuite ajoutés : 20 μL de tampon d'essai, 10 μL de dilutions en série de ce composé, 20 μL d'antagoniste 3H-Smo (concentration finale de 3 nM) et 50 μL de préparation membranaire (40 μg de protéines totales). Les plaques sont incubées à température ambiante pendant 2 heures, puis lavées et séchées sous vide. Les plaques sont ensuite séchées pendant 1 heure dans une étuve à 60°C avant l'ajout de 45 μL de Microscint 20 et incubées à température ambiante pendant 30 minutes à 1 heure, puis comptées dans un compteur à scintillation TopCount. Les données sont analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism.
Gli-Luc/MEF cells are grown in the knockout DMEM supplemented with 10% heat-inactive FBS, 2 mM l-glutamine, and 0.55 mM β-mercaptoethanol until 90% confluence. On day 1, cells are trypsinized and seeded into white 384-well plates in 20 μL per well of OptiMEM media that is supplemented with 1% heat-inactive FBS and 1 mM sodium pyruvate at a concentration of 7,500 cells per well. Plates are incubated at 37 °C and 5% CO2 overnight. On day 2, this compound is added to the cells at a final concentration ranging from 3 μM to 50 pM at a 3-fold serial dilution followed by addition of recombinant mouse Sonic Hedgehog to a final concentration of 2 μg/mL. The cells are incubated with this chemical and Shh for 48 hours at 37 °C and 5% CO2. Luciferase assays are conducted on day 4 using the Bright-Glo Luciferase Assay System. Briefly, Bright-Glo luciferase reagent (25 μL) is added to each well of the 384-well plate containing media. Plates are kept at room temperature for 5 minutes and then read on a Luminescence plate reader. The IC50 value of this compound is calculated.
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