Dacomitinib

Le PF299804 est un inhibiteur spécifique de la famille des kinases ERBB. Ce composé inhibe la signalisation de l'EGFR et induit l'apoptose dans la lignée cellulaire H3255 GR contenant la mutation EGFR T790M. Il est efficace dans les lignées cellulaires NSCLC sensibles et non sensibles. Ce produit chimique inhibe la croissance des cellules H3255 et HCC827 conçues pour exprimer l'EGFR T790M. Il inhibe la phosphorylation de l'EGFR en présence de la mutation T790M. [1] On pense que cet agent inhibe irréversiblement l'activité de la tyrosine kinase ERBB par liaison au site ATP et modification covalente des résidus cystéine nucléophiles dans les domaines catalytiques des membres de la famille ERBB. [2] Il présente des effets inhibiteurs de croissance significatifs dans les cellules de cancer gastrique amplifiées HER2 (SNU216, N87), et il a des valeurs de concentration inhibitrice de 50 % inférieures à celles d'autres inhibiteurs de la tyrosine kinase de l'EGFR, y compris BIBW-2992 et CI-1033. Cet inhibiteur induit l'apoptose et l'arrêt en phase G1 et inhibe la phosphorylation des récepteurs de la famille HER et des voies de signalisation en aval, y compris STAT3, AKT et les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK) dans les cellules de cancer gastrique amplifiées HER2. Il bloque également la formation d'hétérodimères EGFR/HER2, HER2/HER3 et HER3/HER4 ainsi que l'association de HER3 avec p85 α dans les cellules SNU216. [3] Une recherche récente utilise quarante-sept lignées de cellules de cancer du sein humain et de cellules épithéliales mammaires immortalisées pour évaluer les effets inhibiteurs de ce composé ; les résultats indiquent qu'il inhibe préférentiellement la croissance des lignées de cellules de cancer du sein amplifiées HER-2 par rapport aux lignées non amplifiées (RR = 3,39, p < 0,0001). Ce produit chimique réduit la phosphorylation de HER2, EGFR, HER4, AKT et ERK dans la majorité des lignées sensibles. Il exerce son effet antiprolifératif par un arrêt combiné en phase G0/G1 et une induction de l'apoptose. [4]

Le PF299804 administré par voie orale inhibe efficacement la croissance des xénogreffes HCC827 Del/T790M. [1] Une faible administration orale de ce composé (15 mg/kg) provoque une activité antitumorale significative, y compris des régressions tumorales marquées dans une variété de modèles de xénogreffes tumorales humaines qui expriment et/ou surexpriment des membres de la famille ERBB ou contiennent la double mutation (L858R/T790M) dans ERBB1 (EGFR). [2]

• Test de kinase ERBB basé sur ELISA

  Les protéines de fusion cytoplasmiques ERBB1, ERBB2 et ERBB4 sont fabriquées en clonant la séquence ERBB1 (Met-668 à Ala-1211), ERBB2 (Ile-675 à Val-1256) et ERBB4 (Gly-259 à Gly-690) dans le vecteur baculoviral pFastBac par PCR. Les protéines sont exprimées dans des cellules d'insectes Sf9 infectées par le baculovirus sous forme de protéines de fusion GST. Les protéines sont purifiées par chromatographie d'affinité en utilisant des billes de sépharose au glutathion. L'inhibition de l'activité de la tyrosine kinase ERBB est évaluée à l'aide d'un test de tyrosine kinase de récepteur basé sur ELISA. Les réactions de kinase (50 mM HEPES, pH 7,4, 125 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM orthovanadate de sodium, 2 mM dithiothréitol, 20 μM ATP, ce composé ou un contrôle véhicule, et 1-5 nM GST-erbB pour 50 μL de mélange réactionnel) sont réalisées dans des plaques à 96 puits revêtues de 0,25 mg/mL de poly-Glu-Tyr. Les réactions sont incubées pendant 6 minutes à température ambiante sous agitation. Les réactions de kinase sont arrêtées par retrait du mélange réactionnel, puis les puits sont lavés avec un tampon de lavage (0,1 % Tween 20 dans du PBS). Les résidus de tyrosine phosphorylés sont détectés par l'ajout de 0,2 μg/mL d'anticorps anti-phosphotyrosine (Oncogene Ab-4 ; 50 μL/puits) couplé à la peroxydase de raifort (HRP) dilué dans du PBS contenant 3 % de BSA et 0,05 % de Tween 20 pendant 25 minutes sous agitation à température ambiante. L'anticorps est retiré, et les plaques sont lavées avec le tampon de lavage. Le substrat HRP (SureBlue3,3 ,5,5-tétraméthylbenzidine ou TMB) est ajouté (50 μL par puits) et incubé pendant 10-20 minutes sous agitation à température ambiante. La réaction du TMB est arrêtée par l'ajout de 50 μL de solution d'arrêt (0,09 N H₂SO₄). Le signal est quantifié en mesurant l'absorbance à 450 nm. Les valeurs d'IC50 sont déterminées pour ce composé en utilisant la méthode de l'effet médian.

• Lignées cellulaires

  Various NSCLC cell lines

• Concentrations

  0-20 nM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  Growth and inhibition of growth is assessed by 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. This assay, a colorimetric method fordetermining the number of viable cells, is based on the bioreduction of MTS by cells to a formazan product that is soluble in cell culture medium, can be detected spectrophotometrically. The cells are exposed totreatment for 72 hours, and the number of cells used per experiment is determined empirically. All experimental points are set up in 6 to 12 wells, and all experiments are repeated at least thrice. The data are graphically displayed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software). The curves are fitted using a nonlinear regression model with a sigmoidal dose response.

• Modèles animaux

  HCC827-GFP or HCC827-Del/T790M lung cancer cells (in 0.2 mL of PBS) are inoculated s.c. into the lower-right quadrant of the flank of nude mice

• Posologies

  10 mg/kg

• Administration

  Administered via oral gavage