PHA-767491 HCl

Le PHA-767491 présente une sélectivité d'environ 20 fois pour Cdk1, Cdk2 et GSK3-β, une sélectivité de 50 fois pour MK2 et Cdk5 et une sélectivité de 100 fois pour PLK1 et CHK2. Le PHA-767491 inhibe la prolifération cellulaire dans une variété de lignées cellulaires humaines avec des IC50 de 0,86 μM pour SF-268 à 5,87 μM pour K562, et induit significativement l'apoptose de manière p53-indépendante dans presque toutes les lignées cellulaires, contrairement au 5-FU qui ne fonctionne que dans quelques lignées cellulaires. Contrairement aux inhibiteurs actuels de la synthèse de l'ADN, le traitement au PHA-767491 à 5 μM bloque l'initiation de la réplication de l'ADN mais pas la progression de la fourche de réplication, en raison d'une inhibition spécifique de la kinase Cdc7 et de la phosphorylation de Mcm2 au site Ser40 dépendant de Cdc7. [1] Les niveaux de Mcl-1 régulés à la hausse dans les cellules OCI-LY1 et SU-DHL-4 résistantes à l'ABT-737 peuvent être significativement diminués par un traitement au PHA-767491 à 3 μM, probablement en raison de l'inhibition de Cdk9, ce qui conduit à la restauration de la sensibilité à l'ABT-737. [2] L'effet pro-apoptotique direct dépendant des mitochondries du PHA-767491 est également observé lorsqu'il est appliqué à 1 μM dans les cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) quiescentes par un mécanisme similaire avec des EC50 de 0,34-0,97 μM. Tandis que dans les cellules LLC proliférantes stimulées par CD154 et l'interleukine-4, le traitement au PHA-767491 à 5 μM abolit la synthèse de l'ADN en inhibant Cdc7 plutôt qu'en déclenchant la mort cellulaire. [3]

L'administration de PHA-767491 deux fois par jour pendant 5 jours inhibe significativement la croissance du xénogreffe HL60 de manière dose-dépendante avec un TGI de 50 % et 92 % à des doses de 20 mg/kg et 30 mg/kg, respectivement. Cet effet est également marqué dans les modèles de xénogreffe A2780, Mx-1 et HCT-116 ainsi que dans les carcinomes mammaires, et est corrélé à l'inhibition de Cdc7 et à la phosphorylation subséquemment diminuée de Mcm2 au site Ser40 dépendant de Cdc7 [1]

• Tests kinases in vitro

  L'inhibition de Cdc7 et CDK9 par PHA-767491 (IC50) est déterminée à l'aide de l'essai basé sur l'échangeur d'anions fort (résine Dowex 1-X8, forme formate). Pour chaque enzyme, les valeurs K_m absolues pour l'ATP et le substrat spécifique sont initialement déterminées, et chaque essai est ensuite réalisé à des concentrations optimisées d'ATP/³³P-γ-ATP mix (2K_m) et de substrat (5K_m). L'essai kinase de Cdc7 est effectué dans un tampon contenant 50 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl₂, 2 mM β-glycérophosphate, 0,2 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP mix, 5K_m Mcm2 (aa 10-294), 37 nM de Cdc7/Dbf4 recombinant et une concentration croissante de PHA-767491 dans un volume final de 30 μL, et incubé pendant 1 heure à 25 °C. L'essai kinase de CDK9 est effectué en utilisant 50 nM de Cdk9/cyclin T recombinant dans 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP mix, 5K_m peptide CDT d'ARN polymérase et une concentration croissante de PHA-767491 dans un volume final de 30 μL, et incubé pendant 1 heure à 25 °C. Après incubation, 150 μL de résine/formate (pH 3,0) sont ajoutés pour arrêter la réaction et capturer le ³³P-γ-ATP non réagi, le séparant ainsi du substrat phosphorylé en solution. Après 1 heure de repos, un volume de 50 μL de surnageant est transféré dans des plaques à 96 puits Optiplate. Après l'ajout de 150 μL de Microscint 40, la radioactivité est comptée dans le TopCount.

• Lignées cellulaires

  HeLa, MCF7, HCT-116, U2OS, A2780, K562, SF-539, SF-268, Ovcar8, SW480, COLO205, HCT-15, Jurkat, PC3, and NHDF

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Temps dincubation

  24 or 72 hours

• Méthode

  Cells are exposed to PHA-767491 for 24 or 72 hours. Cells are lysed and the ATP content in the well, used as a measure of viable cells, is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay. Activation of caspase-3 and caspase-7 is measured as a ratio between treated sample and untreated control with a luciferase-based assay, containing a specific proluminescent substrate. DNA replication is measured as incorporation of nucleotide analog BrdU into DNA by flow cytometry.

• Modèles animaux

  Female SCID mice subcutaneously implanted with HL60 cells, male Hsd, athymic nu-nu mice subcutaneously implanted with HCT116 cells, A2780 or Mx-1 cells, and female Sprague-Dawley rats with mammary carcinomas

• Posologies

  ~50 mg/kg

• Administration

  Intravenous or oral administration twice a day