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Description biologique
| Spécificité | Poly/Mono-ADP Ribose Antibody [A22J18] reconnaît les niveaux endogènes de protéines ADP-ribosylées et ne présente pas de réactivité croisée avec d'autres modifications post-traductionnelles. |
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| Contexte | Le poly(ADP-ribose) (PAR) et le mono(ADP-ribose) (MAR) sont des modifications post-traductionnelles réversibles médiées par les ADP-ribosyltransférases, en particulier les membres de la famille des PARP (poly(ADP-ribose) polymérases). Le MAR fait référence à l'ajout covalent d'une seule unité d'ADP-ribose – transférée à partir du NAD⁺ – à des résidus d'acides aminés spécifiques (couramment l'aspartate, le glutamate ou la lysine) sur les protéines cibles. En revanche, le PAR est constitué de deux unités d'ADP-ribose ou plus liées par des liaisons glycosidiques ribose-ribose, formant des chaînes linéaires ou ramifiées. Structurellement, chaque unité d'ADP-ribose contribue à ~0,5 kDa, faisant du PAR un polymère large, fortement chargé négativement et flexible, capable d'échafauder divers assemblages protéiques. PARP1, la PARP nucléaire la plus abondante et la plus catalytiquement active, est rapidement activée par les ruptures de brins d'ADN et les signaux de stress, catalysant la PARylation pour recruter et organiser les complexes de DNA Damage/DNA Repair. La MARylation et la PARylation jouent des rôles cellulaires distincts – le MAR régule souvent l'activité ou les interactions de protéines individuelles, tandis que le PAR remplit des fonctions plus larges en tant qu'élément structural dynamique dans des processus tels que le DNA Damage/DNA Repair, le remodelage de la chromatine, la formation de granules de stress, l'assemblage du fuseau mitotique et l'intégrité nucléolaire. L'équilibre entre la synthèse par les PARPs et la dégradation par des enzymes comme la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) et les hydrolases à macrodomaines est essentiel pour maintenir l'homéostasie cellulaire. |
Informations dutilisation
| Application | WB, IF | Dilution |
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| Réactivité | All | ||||||
| Source | Rabbit Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampon de stockage | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ | Stockage (À partir de la date de réception) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol：
Specimen Preparation
1. Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% Paraformaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Paraformaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
2. Fix cells for 15 min at room temperature.
3. Aspirate fixative, rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
4. Proceed with Immunostaining.
Immunostaining
1. Add theblocking buffer and incubate for 60 min at RT.
2. Prepare primary antibody diluent in antibody dilution buffer as recommended .
3. Aspirate blocking solution, apply diluted primary antibody.
4. Incubate overnight at 4°C.
5. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
6. Incubate specimens in fluorochrome-conjugated secondary antibody diluted in antibody dilution buffer for 1–2 hr at room temperature in the dark.
7. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
8. Mount slides usingmounting medium with DAPI and cover with coverslips.
9. For best results, allow mountant to cure overnight at room temperature. For long-term storage, store slides flat at 59°C protected from light.
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| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Références
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