Rapamycin (Sirolimus)

La Rapamycin inhibe l'activité endogène de mTOR dans les cellules HEK293 avec une IC50 d'environ 0,1 nM, plus puissamment que l'iRap et l'AP21967 avec des IC50 d'environ 5 nM et 10 nM, respectivement. [1] Chez Saccharomyces cerevisiae, le traitement par ce composé induit un arrêt sévère du cycle cellulaire G1/S et une inhibition de l'initiation de la traduction à des niveaux inférieurs à 20% du contrôle. [2] Il inhibe significativement la viabilité cellulaire de T98G et U87-MG de manière dose-dépendante avec des IC50 de 2 nM et 1 μM, respectivement, tout en affichant peu d'activité contre les cellules U373-MG avec une IC50 de >25 μM malgré l'étendue similaire de l'inhibition de la signalisation mTOR. Ce produit chimique (100 nM) induit un arrêt en G1 et l'Autophagy mais pas l'apoptose dans les cellules U87-MG et T98G sensibles à la Rapamycin en inhibant la fonction de mTOR. [3]

Le traitement par la Rapamycin in vivo bloque spécifiquement les cibles connues pour être en aval de mTOR, telles que la phosphorylation et l'activation de la p70S6K et la libération de l'inhibition de l'eIF4E par PHAS-1/4E-BP1, entraînant un blocage complet des augmentations hypertrophiques du poids du muscle plantaire et de la taille des fibres. [4] Un traitement à court terme avec ce composé, même à la dose la plus faible de 0,16 mg/kg, produit une inhibition profonde de l'activité de la p70S6K, ce qui est corrélé à une augmentation de la mort des cellules tumorales et de la nécrose des tumeurs rénales d'Eker. [5] Ce produit chimique inhibe la croissance tumorale métastatique et l'angiogenèse dans les modèles de xénogreffe CT-26 en réduisant la production de VEGF et le blocage de la signalisation des cellules endothéliales induite par le VEGF. [6] Le traitement avec ce composé à 4 mg/kg/jour réduit significativement la croissance tumorale des xénogreffes C6 et la perméabilité vasculaire tumorale. [7]

• Immunoblotting pour l'essai kinase mTOR

  Les cellules HEK293 sont ensemencées à 2-2,5×10⁵ cellules/puits d'une plaque de 12 puits et privées de sérum pendant 24 heures dans du DMEM. Les cellules sont traitées avec des concentrations croissantes de Rapamycin (0,05-50 nM) pendant 15 minutes à 37 °C. Du sérum est ajouté à une concentration finale de 20% pendant 30 minutes à 37 °C. Les cellules sont lysées et les lysats cellulaires sont séparés par SDS-PAGE. Les protéines résolues sont transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène et immunobuvardées avec un anticorps primaire phosphospécifique dirigé contre la Thr-389 de la p70 S6 kinase. Les données sont analysées à l'aide d'ImageQuant et de KaleidaGr

• Lignées cellulaires

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• Modèles animaux

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• Posologies

  ~4 mg/kg/day

• Administration

  Injection i.p.