Salirasib

Des membranes synaptosomales du cervelet de cerveau de rat ou des membranes totales de lignées cellulaires cultivées (culot à 100 000 × g) sont utilisées pour les essais de méthyltransférase dans des systèmes acellulaires. Les essais de méthyltransférase sont réalisés à 37 °C dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, en utilisant 100 μg de protéines, 25 μM de [méthyl-³H]AdoMet (300 000 cpm/nmol) et 50 μM d'AFC (préparé sous forme de solution mère dans du DMSO) dans un volume total de 50 μL. La concentration de DMSO dans tous les essais est de 8 %. Diverses concentrations de ce composé sont utilisées dans plusieurs expériences comme indiqué dans le texte. Les réactions sont arrêtées après 10 min par addition de 500 μL de chloroforme:méthanol (1:1) avec addition subséquente de 250 μL d'H₂O, mélange et séparation des phases. Une portion de 125 μL de la phase chloroformique est séchée à 40 °C, et 200 μL de 1 N NaOH, 1 % de solution de SDS sont ajoutés. Le méthanol ainsi formé est compté par la méthode d'équilibre de la phase vapeur. Les comptages de fond typiques (sans AFC ajouté) sont de 50-100 cpm, tandis que les réactions typiques avec ce produit chimique donnent 500-6 000 cpm. Les essais sont réalisés en triple exemplaire, et les comptages de fond sont soustraits. La méthylation des substrats endogènes et l'électrophorèse sur gel sont effectuées. La méthylation du carboxyle des protéines dans les cellules intactes est déterminée en utilisant 100 μCi/mL de [méthyl-³H]méthionine. Les cellules sont analysées dans des cultures quasi confluentes cultivées dans des plaques de 10 cm avec 5 mL de milieu de marquage.

PC12, CHE, T-antigen-transformed CHE, endothelial cells, astrocytes, B16, Rat1, EJ, NIH3T3, v-Raf-transformed NIH3T3 cell lines

~100 μM

10 days

Cells are grown in 24-well plates. 2 h after plating, the cells receive either solvent or this compound freshly prepared from a stock solution to yield the final indicated concentrations in 0.1% DMSO. Media are replaced every 4 days with fresh medium containing the solvent or the drug. Separate experiments indicate that the solvent itself has no effect on cell growth. On the indicated days, the cells are detached from plates by trypsin/EDTA and counted under the light microscope. All assays are performed in quadruplicate. In parallel experiments, cells are stained either with trypan blue or with MTT, and the stained cells are examined under the light microscope. In some MTT-stained cultures, the cells are dissolved in 0.2 mL of 100% DMSO, and the extent of staining is determined spectrophotometrically using an enzyme-linked immunosorbent assay reader.

Panc-1 xenografted nude mice

5 mg/kg daily

i.p.