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Description biologique
| Spécificité | SSEA4 Antibody [E20H6] détecte les niveaux endogènes de la protéine SSEA4 totale. |
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| Contexte | SSEA4 (Stage-Specific Embryonic Antigen 4) est un épitope glycolipidique hexasaccharide sialylé (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-Cer) trouvé sur les cellules souches embryonnaires humaines (hESC), les cellules souches pluripotentes induites (iPSC), les cellules de tératocarcinome et les cellules souches cancéreuses, mais absent des cellules somatiques différenciées ou des cellules pluripotentes de souris. Son groupe de tête glucidique adopte une conformation en forme de fer à cheval reconnue par les anticorps MC813 via un réseau de liaisons hydrogène impliquant le carboxylate d'acide sialique terminal (Neu5Ac) avec Asp54H/Gly53H et les hydroxyles N-acétyl GalNAc avec Asp49L, ce qui sous-tend son utilité pour la détection spécifique des états de pluripotence par cytométrie en flux et immunohistochimie. La liaison α-Gal rigide et les liaisons glycosidiques β1-3 du glycan maintiennent une conformation stable et étendue au sommet des queues lipidiques de céramide dans les membranes plasmatiques, où SSEA4 soutient activement la pluripotence en modulant la signalisation Wnt/β-caténine par interaction directe avec le co-récepteur LRP6, permettant une activation du pathway indépendante du ligand, et en recrutant PI3K/Akt par un regroupement médié par le glycan qui maintient le circuit Nanog/Oct4/Sox2 essentiel à l'auto-renouvellement. Pendant la différenciation, la régulation négative des glycosyltransférases (ST3GAL6, B3GALT5) élimine progressivement l'acide sialique terminal, convertissant SSEA4 en SSEA3 et éteignant sa compétence de signalisation. |
Informations dutilisation
| Application | IF, FCM | Dilution |
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|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Réactivité | Human | ||||||
| Source | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampon de stockage | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Stockage (À partir de la date de réception) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Références
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