Sulforhodamine B sodium salt

Dosage colorimétrique de Sulforhodamine B en culture cellulaire pour analyser la prolifération cellulaire
1. Préparez des solutions de traitement avec un volume suffisant pour des triplicats dans des plaques à 96 puits (50 μl par réplicat) ou six réplicats dans des plaques à 384 puits (10 μl par réplicat). Assurez-vous que les volumes tiennent compte des variations de pipetage.
2. Les solutions de traitement peuvent être préparées soit en solution aqueuse (par exemple, Opti-MEM pour les transfections), soit dans un solvant approprié (par exemple, DMSO).
3. Retirez le milieu des monocouches cellulaires et lavez les cellules une fois avec du PBS stérilisé. Ajoutez 1 ml (pour les plaques de 100 mm) de trypsine à 0,25 % pour couvrir uniformément la surface de croissance cellulaire.
4. Incuber à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se dissocier. Inactiver la trypsine avec 10 volumes de milieu de culture contenant du FBS. Mélanger de haut en bas pour obtenir une suspension homogène de cellules uniques.
5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube Falcon stérile.
6. Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'une chambre d'hématocytomètre avec un mélange 1:1 de suspension cellulaire et de solution de bleu trypan à 0,4 %. En option, centrifuger les cellules avant de compter pour laver la trypsine et resuspendre dans un milieu de croissance.
7. Ajuster la concentration cellulaire avec un milieu de croissance (10 % FBS) pour une densité de semis cellulaire appropriée par puits.
8. Mélanger les solutions de traitement et distribuer 50 μl (format 96 puits) ou 10 μl (format 384 puits) dans chaque puits.
9. Mélanger soigneusement la suspension cellulaire et ajouter 50 μl (format 96 puits) ou 10 μl (format 384 puits) à chaque puits avec les solutions de traitement.
Note : Assurer une distribution uniforme des cellules au fond du puits, en évitant de secouer pour éviter les 'effets d'anneau'.
10. Mettre de côté trois puits pour le contrôle non traité ou le véhicule et trois puits pour la soustraction du fond et incuber la plaque à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu'à ce qu'elle soit prête pour la lecture.
11. Ajouter 25 μl (format 96 puits) ou 5 μl (format 384 puits) de TCA froid à 50 % directement au surnageant du milieu. Incuber les plaques à 4 °C pendant 1 heure sans mélanger.
12. Laver les plaques quatre fois en les submergeant dans de l'eau du robinet à faible débit, et en tapotant l'excès d'eau sur une serviette en papier. Laisser la plaque sécher à l'air libre à température ambiante.
13. Ajouter 50 μl (format 96 puits) ou 20 μl (format 384 puits) de solution de SRB à 0,04 % à chaque puits.
14. Incuber à température ambiante pendant 1 heure et rincer les plaques quatre fois avec 1 % d'acide acétique (200 μl pour le format 96 puits ou 30 μl pour le format 384 puits). Laisser la plaque sécher à l'air libre à température ambiante.
15. Ajouter 50 μl à 100 μl de solution de base Tris à 10 mM (pH 10,5) à chaque puits et agiter la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 minutes pour solubiliser le colorant lié aux protéines.
16. Mesurer l'absorbance à 510 nm dans un lecteur de microplaques.