Tiplaxtinin (PAI-039)

L'essai chromogène est initié par l'ajout de Tiplaxtinin (PAI-039) (concentration finale de 10 à 100 µM, concentration maximale de DMSO de 0,2%) à du PAI-1 humain recombinant (140 nM dans un tampon pH 6,6). Après une incubation de 15 minutes à 25°C, 70 nM de t-PA humain recombinant sont ajoutés, et la combinaison de ce composé, PAI-1 et tPA est incubée pendant 30 minutes supplémentaires. Après la deuxième incubation, du Spectrozyme tPA est ajouté et l'absorbance est lue à 405 nm à 0 et 60 minutes. L'activité inhibitrice relative du PAI-1 est égale à l'activité résiduelle du tPA dans le traitement au Tiplaxtinin/PAI-1. Les traitements témoins incluent l'inhibition complète du tPA par le PAI-1 au rapport molaire utilisé (2:1), et l'absence de tout effet sur le t-PA seul. L'essai immunofonctionnel est basé sur l'interaction non dissociable par le SDS entre le tPA et le PAI-1 actif. Les plaques d'essai sont recouvertes de 100 µl d'une solution de t-PA (10 µg/ml dans du TBS), et conservées à 4°C pendant une nuit. Ce composé est dissous dans du DMSO et dilué à une concentration finale de 1-100 µM comme décrit ci-dessus. Il est ensuite incubé avec du PAI-1 humain (50 ng/ml) pendant 15 minutes, et une aliquote de cette solution est ajoutée à la plaque recouverte de t-PA pendant 1 heure. La solution est aspirée de la plaque, qui est ensuite lavée avec un tampon composé de 0,05% de Tween 20 et 0,1% de BSA dans du TBS. Cet essai détecte uniquement le PAI-1 actif inhibiteur (non latent ou substrat) lié à la plaque, et est quantifié à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre le PAI-1 humain (MA33B8). Une dilution au 1000X de MA33B8 est ajoutée à la plaque et incubée pendant une heure, aspirée et lavée. Un anticorps secondaire composé d'un conjugué de phosphatase alcaline de chèvre anti-souris IgG (H+L)-AP est ajouté, incubé pendant une heure, aspiré et lavé. Une aliquote de 100 µl de solution de phosphatase alcaline est ajoutée, suivie de la détermination de l'absorbance à 405 nm 60 minutes plus tard. La quantification du PAI-1 actif résiduel lié au t-PA à différentes concentrations est utilisée pour déterminer l'IC50 en ajustant les résultats à un programme de dose-réponse logistique, l'IC50 étant définie comme la concentration du composé nécessaire pour atteindre 50% d'inhibition de l'activité du PAI-1. La sensibilité de l'essai est de 5 ng/ml de PAI-1 humain, déterminée à partir d'une courbe standard allant de 0 à 100 ng/ml de PAI-1 humain.

T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells

~50 μM

24 h

Briefly, cell lines, T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells are plated in 96-well dishes in triplicate at 1 ?10³ cells per well and allowed to adhere for 24 hours. Subsequently, tiplaxtinin (PAI-039) is added to the wells and allowed to incubate at the indicated concentrations. Cellular proliferation is determined by CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay according to manufacturer's instructions at 24 hours, and its IC50 is determined in Graphpad Prism. Luminescence was measured using a FLUOstar OPTIMA Reader.

Rat with carotid thrombosis

1 mg/kg

p.o.