Vadimezan (DMXAA)

L'activité de l'enzyme DT-diaphorase purifiée est mesurée par la réduction du cytochrome c à 550 nm sur un spectrophotomètre Beckman DU 650. Chaque essai contient du cytochrome c (70 μM), du NADH (concentrations variables), de la DT-diaphorase purifiée (0,032 μg) et de la ménadione (concentrations variables) dans un volume final de 1 mL de tampon Tris–HCl (50 mM, pH 7,4) contenant 0,14% de BSA. La réaction est initiée par l'ajout de NADH. Les vitesses de réduction sont calculées sur la partie initiale de la courbe de réaction (30 secondes), et les résultats sont exprimés en μmol de cytochrome c réduit/min/mg de protéine en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 21,1 mM⁻¹ cm⁻¹ pour le cytochrome c réduit. Les essais enzymatiques sont réalisés à température ambiante et toutes les réactions sont effectuées en triplicate. L'inhibition de l'activité de la DT-diaphorase purifiée est réalisée par l'inclusion de Vadimezan (DMXAA) à diverses concentrations dans la réaction, et les caractéristiques d'inhibition sont déterminées en variant la concentration de NADH (ménadione constante) ou de ménadione (NADH constant) à plusieurs concentrations de ce composé. Les valeurs de K_i sont obtenues en traçant 1/V contre. L'activité de la DT-diaphorase dans les cellules DLD-1 est déterminée en mesurant la réduction du DCPIP sensible au dicoumarol à 600 nm. Brièvement, les cellules DLD-1 en croissance exponentielle sont récoltées par raclage dans un tampon froid (Tris–HCl, 25 mM, pH 7,4 et 250 mM de saccharose) et soniquées sur glace. Les conditions d'essai enzymatique sont 2 mM de NADH, 40 μM de DCPIP, 20 μL de dicoumarol (si nécessaire) dans un volume final de 1 mL de Tris–HCl (25 mM, pH 7,4) contenant de la BSA (0,7 mg/mL). Les résultats sont exprimés comme la réduction du DCPIP sensible au dicoumarol en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 21 mM⁻¹ cm⁻¹. Les niveaux de protéines sont déterminés en utilisant le dosage de Bradford.

DLD-1 and H460 cells

0-2 mM

96 hours

DLD-1 human colon carcinoma and H460 human non-small cell lung carcinoma cells are routinely maintained as monolayer cultures in RPMI 1640 culture medium supplemented with foetal calf serum (10%), sodium pyruvate (2 mM), penicillin/streptomycin (50 IU mL⁻¹/50 μg mL^-1) and l-glutamine (2 mM). Chemosensitivity is assessed using the MTT assay and all assays are performed under aerobic conditions. Briefly, cells are plated into each well of a 96-well culture plate and incubated overnight in an atmosphere containing 5% CO₂. Culture medium is completely removed from each well and replaced with medium containing a range of drug concentrations. In the case of menadione alone, the duration of drug exposure is 1 hour, after which the cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of 200 μL fresh RPMI 1640 medium to each well of the plate. For Vadimezan (DMXAA) alone, the duration of exposure is 3 hours. Following a four-day incubation, cell survival is determined using the MTT assay. For combinations of this compound with menadione, cells are initially set up and a non-toxic (>95% cell survival) concentration of it is selected. Cells are then initially exposed to DMXAA (2 mM) for a period of 2 hours, following which the medium is removed and replaced with medium containing the inhibitor (at a constant concentration of 2 mM) and menadione (at a range of drug concentrations). Following a further 7-hour incubation, cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of growth medium.

Chemical carcinogen (NMU) is injected into female Wistar rats.

≤300 mg/kg

Administered via i.p.