Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

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Avantages

Réactifs	CCK-8 (WST®-8)	WST-1	XTT/MTS	MTT
Propriété	1-bottle solution	1-bottle solution	2-bottle solution	powder
Préparation	Ready-to-use	Ready-to-use	Mix before use	Dissolve before use
Lecture	430-490 nm	420-480 nm	420-480 nm	560-600 nm
Solubilité aqueuse du formazan	+++++	+++	++	-
Sensibilité	+++++	+++	+++	+
Temps dincubation	+	+	+++	+++++
Toxicité	+	+	+++	+++++
Stabilité du réactif	+++++	+++	+	+++
Adaptation HTS	+++++	+++	+++	+
Commodité	+++++	+++	+++	+

Comparaison de produits

Description

Le Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est une solution prête à lemploi en une seule bouteille qui offre une mesure simple, rapide, fiable et sensible de la viabilité cellulaire et de la cytotoxicité de diverses substances chimiques. De plus, le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est très sûr, rapide, non radioactif et rentable par rapport aux autres méthodes conventionnelles telles que le test dincorporation de la [3H]-thymidine.

Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est un indicateur redox qui utilise le sel de tétrazolium hautement hydrosoluble WST®-8 [2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium, sel monosodique] pour produire un colorant formazan hydrosoluble lors de la réduction par les déshydrogénases cellulaires en présence dun transporteur délectrons 1-Méthoxy PMS dans le milieu de culture (Figure 1). La quantité de colorant formazan générée par lactivité des déshydrogénases dans les cellules est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes (Figure 2). La sensibilité de détection du Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est supérieure à celle dautres sels de tétrazolium tels que le MTT, le XTT, le MTS ou le WST-1.

Figure 1 : Mécanismes de fonctionnement du Cell Counting Kit-8 (CCK-8).

Figure 2 : Nombre de cellules vs valeur DO en utilisant le Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Les cellules K562 et Hela ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à différentes densités dans 100 μl de milieu de culture en triple exemplaires respectivement. 16 heures plus tard, 10 μl/puits de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ont été ajoutés, permettant une culture continue pendant la durée indiquée dans lincubateur de culture cellulaire. Labsorbance à 450 nm a ensuite été mesurée dans un lecteur de microplaques. Les puits contenant uniquement du milieu ont servi de contrôle à blanc. Notez la grande relation linéaire entre le nombre de cellules par puits et les valeurs dOD450 à tous les temps dincubation.

Figure 3 : Développement de la couleur dépendant du temps en utilisant le Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Les cellules HEK293 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à différentes concentrations dans 100 μl de milieu de culture en triple exemplaires. 16 heures plus tard, 10 μl/puits de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ont été ajoutés, permettant aux cellules de se cultiver en continu pendant la durée indiquée dans lincubateur de culture cellulaire. Labsorbance à 450 nm a ensuite été mesurée dans un lecteur de microplaques. Notez la relation hautement linéaire entre le développement de la couleur et le temps dincubation à toutes les concentrations cellulaires.

Stockage (à partir de la date de réception)

Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est stable pendant 6 mois à température ambiante, 2 ans à 0-5°C avec protection contre la lumière. Pour un stockage à long terme, conserver à -20°C et en dessous.

Protocole

Matériaux requis (non inclus)

• lecteur de microplaques (filtre 450 nm)
• 10 μl, 100-200 μl et pipettes multicanaux.
• 1 % SDS (facultatif).

Procédure expérimentale

1) Inoculer les cellules dans un flacon ou une boîte de culture cellulaire et laisser les cellules adhérer ou se développer pendant environ 4 à 24 heures avant de poursuivre lessai.
2) Ajouter 1/10 du volume de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) directement aux cellules dans le milieu de culture. Mélanger soigneusement pour obtenir une solution homogène en tapotant légèrement lextérieur de la plaque plusieurs fois tout en évitant les bulles. Pour une plaque à 96 puits, ajouter 10 µl de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour 100 µl de milieu de culture.
3) Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 0,5 à 4 heures à 37°C jusquà ce que la couleur vire à lorange. Une incubation excessive donnera des résultats erronés.
Remarque : La sensibilité de détection augmente avec des temps dincubation plus longs. Pour les échantillons contenant moins de cellules, utiliser un temps dincubation plus long, jusquà 24 heures.
4) Enregistrer les résultats à laide dun lecteur de microplaques pour mesurer labsorbance du Cell Counting Kit-8 (CCK-8) à 450 nm. Les valeurs DO recommandées se situent entre 0,8 et 1,5, mais des valeurs entre 0,5 et 2,5 sont acceptables.
Remarque : Une légère absorbance spontanée autour de 450 nm se produit dans le milieu de culture incubé avec Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Cette absorbance de fond dépend du milieu de culture, du pH, du temps dincubation et de la durée dexposition à la lumière. Labsorbance de fond typique après 2 heures dincubation est de 0,1 à 0,2 unités dabsorbance. Pour corriger cela, préparer un ou plusieurs puits témoins sans cellules et soustraire labsorbance moyenne des puits témoins de celle des autres puits.
5) Facultatif : Ajouter 10 μl de SDS à 1 % (dissoudre 0,1 g de SDS avec un tampon PBS pour préparer 10 ml de solution) directement à 100 μl de cellules pour arrêter la réaction. Les signaux peuvent être lus dans les 3 jours sans affecter les valeurs dabsorbance.
6) Calcul de la viabilité cellulaire :
Viabilité cellulaire (%)
A (Médicament+) : valeur DO des puits avec cellules, CCK-8 et médicaments ;
A (Médicament-) : valeur DO des puits avec cellules, CCK-8, mais sans médicaments ;
A (Blanc) : valeur DO des puits avec milieu de culture et CCK-8, mais sans cellules.

Bref résumé du protocole

Applications

1) Déterminations de la prolifération cellulaire – le Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est soluble dans leau, stable en culture et non toxique.
2) Tests de viabilité cellulaire – lactivité métabolique et la génération de colorant changent proportionnellement à la viabilité altérée.
3) Tests de cytokines – mesurer la prolifération induite par les cytokines. Les cellules peuvent être récupérées et expandues à la fin de létude si désiré.
4) Tests de cytotoxicité – la mort cellulaire due à des produits chimiques cytotoxiques na aucun effet sur le développement de la couleur, seules les cellules vivantes convertissent le réactif en un indicateur colorimétrique. Le réactif lui-même a une toxicité négligeable et est généralement sûr pour les cellules.

Note

1. Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) est une solution prête à lemploi. Mélanger le réactif pour assurer une solution homogène avant utilisation.
2. Si vous prévoyez dutiliser un temps dincubation plus long (nuit), assurez-vous de maintenir des conditions stériles pendant lajout du réactif et lincubation afin déviter les contaminants microbiens. Les cultures contaminées donneront des résultats erronés car les contaminants microbiens réduisent également le Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
3. Assurez-vous dinclure des contrôles dessai appropriés. Pour minimiser les erreurs expérimentales, nous recommandons deffectuer des mesures à partir dun minimum de 3 à 8 répétitions de lexpérience et du contrôle uniquement sur le milieu.
4. Ce produit est destiné uniquement à la R&D, pas à des usages médicaux, domestiques ou autres.

Dépannage

Problèmes	Cause(s) potentielle(s)	Suggestion(s)
Les valeurs DO sont trop élevées (>2.5)	Trop de cellules dans le puits.	Réduire le nombre de cellules. Une prédétermination de la relation entre le nombre de cellules et les lectures de D.O est recommandée.
Les valeurs DO sont trop élevées (>2.5)	Le temps dincubation est trop long.	Raccourcir le temps dincubation.
Les valeurs de DO sont trop faibles. (<0.3)	Trop peu de cellules par puits.	Augmenter le nombre de cellules. La prédétermination de la relation entre le nombre de cellules et les lectures de DO est recommandée.
	La viabilité cellulaire est trop faible pour être testée avec le Cell Counting Kit-8 (CCK-8).	Augmenter le nombre de cellules par puits et le temps dincubation. Si cela ne fonctionne pas, choisir dautres kits plus sensibles.
	Le temps dincubation est trop court.	Augmenter le temps dincubation, jusquà 24 h est acceptable.
	Une mauvaise longueur donde de lecture est utilisée.	Utiliser le filtre optique ou régler le monochromateur entre 450 nm et 490 nm pour lire labsorbance.
La couleur est développée par les cellules mortes.	Les composés dessai peuvent réduire le WST®-8.	Si un développement de couleur se produit en mélangeant et en incubant le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) et les composés dessai, échanger le milieu de culture puis ajouter le Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
La couleur est développée par les cellules mortes.	Le lysat cellulaire peut réduire le WST®-8.	Échanger le milieu de culture frais puis ajouter le Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
Les données varient entre les puits.	Les puits nont pas été bien mélangés après lajout du Cell Counting Kit-8 (CCK-8).	Échanger le milieu de culture frais puis ajouter le Cell Counting Kit-8 (CCK-8), mélanger soigneusement en tapotant légèrement lextérieur du puits et incuber à nouveau.
	Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) nest pas bien mélangé après un stockage prolongé ou a été exposé à la congélation et à la décongélation.	Mélanger soigneusement le Cell Counting Kit-8 (CCK-8), échanger le milieu de culture frais et ré-ajouter le Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
	Des bulles sont présentes dans les puits.	Percer les bulles avec un cure-dent.
	Les nombres de cellules varient entre les puits.	Réensemencer les cellules et répéter lessai complet.
	Leffet de bord dune plaque.	Ne pas utiliser les puits les plus externes pour lessai. Ajouter seulement du milieu à ces puits.
Labsorbance du puits avec un composé dessai est plus élevée que celle du contrôle négatif.	Le composé favorise la viabilité cellulaire même sil sagit dune substance toxique.	Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) fonctionne toujours de bonne foi dans une telle situation. Changer pour un autre kit dessai avec des principes différents.
Valeurs dabsorbance de fond (blanc) élevées.	Le réactif peut se décomposer en raison de multiples cycles de congélation/décongélation.	Assurez-vous de conserver le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) à 0-5 °C dans un endroit sombre. Ne pas utiliser de produits périmés.

Téléchargement de fichier

Manual
SDS