NH125 CaMK inhibiteur

Dans les cellules de gliome C6, NH125 diminue le contenu cellulaire de phospho-eEF-2 sans affecter le contenu total d'eEF-2, et bloque le transit du cycle cellulaire à la limite G1-S. Ce composé inhibe puissamment la viabilité cellulaire de 10 cellules cancéreuses avec des IC50 allant de 0,7 à 4,8 μM. [1] Il inhibe efficacement les histidine protéines kinases, y compris Envz, PhoQ, BvgS, EvgS, et produit ainsi de puissantes activités antibactériennes sur Staphylococcus aureus résistant à l'oxacilline (ORSA), Enterococcus faecalis résistant à la vancomycine (VRE), Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline (PRS) et d'autres bactéries Gram-positives et Gram-négatives. [2] L'inhibition de l'EEF2K par ce produit chimique rend les cellules tumorales plus sensibles à la curcumine et au velcade, qui possèdent une action inductrice de stress du RE. [3]

Essai de l'eEF-2 Kinase

L'activité de l'eEF-2 kinase est mesurée par deux méthodes : (a) un essai basé sur filtre ; et (b) par immunobuvardage utilisant un anticorps anti-phospho-eEF2. Pour ces deux méthodes, les réactions sont réalisées dans un volume total de 20 μl contenant 50 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 100 μg/ml de calmoduline, 2 μM d'eEF-2 étiqueté His et 400 nM de GST-eEF-2 kinase, et un mélange d'ATP [50 μM d'ATP avec 1 μCi (γ-³³P)ATP]. Le mélange de kinase sans ATP est préparé sur glace puis préincubé pendant 15 min à température ambiante. Les réactions de kinase sont démarrées par l'ajout d'ATP et laissées à progresser à 30°C pendant 30 min. Pour l'essai basé sur filtre, la réaction est arrêtée par l'ajout de 20 μl d'acide phosphorique froid à 1,5%, et 5 μl de la réaction sont appliqués sur du papier phosphocellulose P81 Whatman. Le papier est lavé trois fois dans 500 ml d'acide phosphorique à 0,5% et une fois avec 200 ml d'acétone. Le papier est ensuite séché à l'air libre et immergé dans 10 ml de mélange de scintillation. La radioactivité est comptée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide Beckton-Dickinson. Pour l'immunobuvardage, les réactions sont arrêtées par l'ajout de 20 μl de tampon Lamelli 3× [190 mM Tris (pH 6,8), 6% SDS, 30% glycérol, 15% 2-mercaptoéthanol et 0,003% de bleu de bromphénol]. Les échantillons sont bouillis pendant 5 min et résolus par SDS-PAGE à 7% et traités pour le Western blotting comme décrit ci-dessous. Les conditions pour les deux essais sont choisies pour assurer la linéarité de la réaction par rapport au temps d'incubation et à la concentration d'enzyme.

NH125 réduit la pression artérielle chez les SHR et la production de ROS, l'induction de molécules inflammatoires et l'hypertrophie dans l'artère mésentérique supérieure des SHR. [4]