PNU-120596 AChR modulateur

PNU-120596 augmente le flux de calcium évoqué par l'agoniste (Ach) médiatisé par une variante modifiée du α7 nAChR humain. Ce composé augmente les courants évoqués par les agonistes (choline et ACh) médiatisés par les récepteurs de type sauvage et démontre également une prolongation prononcée de la réponse évoquée en présence continue d'agoniste dans les ovocytes de Xenopus. Il augmente le temps moyen d'ouverture des canaux des α7 nAChRs mais n'a aucun effet sur la sélectivité ionique et relativement peu, voire pas du tout, d'effet sur la conductance unitaire. Lorsqu'il est appliqué à des tranches hippocampiques aiguës, ce produit chimique augmente la fréquence des courants postsynaptiques GABAergiques évoqués par l'ACh mesurés dans les neurones pyramidaux ; cet effet est supprimé par le TTX, suggérant qu'il module la fonction des α7 nAChRs situés sur la membrane somatodendritique des interneurones hippocampiques. [1] Outre la modulation positive du α7 nAChR, ce composé induit un profond ralentissement de la cinétique de désensibilisation, augmentant le potentiel de toxicité induite par le Ca²⁺ par une stimulation excessive du α7 nAChR. [2] Il provoque des changements dans l'accessibilité de la cystéine au niveau du feuillet bêta interne, de la zone de transition et du site de liaison de l'agoniste lors de la liaison au α7 nAChR. Les sites de liaison de ce produit chimique ne se trouvent pas dans les sites de liaison de l'agoniste et il améliore l'ouverture des récepteurs nicotiniques évoquée par l'agoniste en induisant des effets conformationnels similaires mais non identiques aux conformations d'ouverture promues par l'Ach. [3]

Test de fluorescence Ca²⁺

Des cellules épithéliales humaines SH-EP1 exprimant une variante du α7 nAChR (α7^*) sont cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) contenant des acides aminés non essentiels supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, de la L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 250 ng/mL de fungizone, 400 μg/mL d'hygromycine B et 800 μg/mL de généticine. α7^* est une variante du α7 nAChR humain, avec deux mutations ponctuelles dans le premier domaine transmembranaire (T230P et C241S) qui permettent une expression fonctionnelle élevée dans les cellules SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37 °C avec 6 % de CO₂. Les cellules sont trypsinisées et ensemencées dans des plaques à 96 puits avec des parois latérales sombres et des fonds clairs à une densité de 2 × 10⁴ cellules/puits 2 jours avant l'analyse. Les cellules sont chargées avec un mélange de Calcium Green-1 AM dans du diméthylsulfoxyde anhydre et 20 % de pluronic F-127. Ce réactif est ajouté directement au milieu de croissance de chaque puits pour atteindre une concentration finale de 2 μM de Calcium Green-1 AM. Les cellules sont ensuite incubées dans le colorant pendant 1 heure à 37 °C, puis lavées quatre fois avec la solution saline équilibrée d'Earle modifiée de Mark (MMEBSS) composée des éléments suivants (en mM) : 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucose, 20 Tris-HEPES et 120 N-méthyl-D-glucamine, pH 7,4. Après le quatrième cycle, les cellules sont laissées à incuber à 37 °C pendant au moins 10 minutes. Le volume final de MMEBSS dans chaque puits est de 100 μL et de l'atropine est ajoutée à tous les puits pour une concentration finale de 1 μM. Un lecteur de plaques d'imagerie fluorométrique (FLIPR ; Molecular Devices, Union City, CA) est configuré pour exciter le Calcium Green à 488 nm en utilisant 500 mW de puissance et en lisant l'émission de fluorescence >525 nm. Une exposition de 0,5 seconde est utilisée pour illuminer chaque puits. La fluorescence est détectée à l'aide d'un diaphragme réglé à 2,0 ou 1,2. Après 30 secondes d'enregistrement de base, les composés d'essai sont ajoutés à chaque puits d'une plaque à 96 puits dans 50 μL d'une solution stock 3 ×. Dans chaque expérience, quatre puits sont utilisés comme contrôles de véhicule (0,2 % DMSO).

L'administration systémique de PNU-120596 (1 mg/kg) à des rats améliore le déficit de régulation auditive causé par l'amphétamine, un modèle proposé pour refléter une perturbation au niveau du circuit associée à la schizophrénie. [1] Lorsqu'il est administré avant la carragénine, 30 mg/kg de ce composé atténuent significativement l'hyperalgésie mécanique et les déficits de port de poids jusqu'à 4 heures. Ce produit chimique atténue l'augmentation induite par la carragénine des niveaux de TNF-α et d'IL-6 dans l'œdème de la patte arrière, le diclofénac n'atténuant que les niveaux d'IL-6. L'hyperalgésie mécanique établie induite par la carragénine ou le CFA est également partiellement inversée par cet agent. [4]