PNU-120596 AChR Modulateur

PNU-120596 increases agonist (Ach)-evoked calcium flux mediated by an engineered variant of the human α7 nAChR. This compound increases agonists (choline and ACh)-evoked currents mediated by wild-type receptors and also demonstrates a pronounced prolongation of the evoked response in the continued presence of agonist in Xenopus oocytes. It increases the channel mean open time ofα7 nAChRs but has no effect on ion selectivity and relatively little, if any, effect on unitary conductance. When applied to acute hippocampal slices, this chemical increases the frequency of ACh-evoked GABAergic postsynaptic currents measured in pyramidal neurons; this effect is suppressed by TTX, suggesting that it modulates the function of α7 nAChRs located on the somatodendritic membrane of hippocampal interneurons. [1] Besides the positive modulation to α7 nAChR, this compound induces a profound retardation of the kinetics of desensitization, raising the potential of Ca²⁺-induced toxicity through excessive stimulation of α7 nAChR. [2] It causes changes in cysteine accessibility at the inner beta sheet, transition zone and agonist binding site while binding to α7 nAChR. Binding sites for this chemical are not in the agonist-binding sites and it enhances agonist-evoked gating of nicotinic receptors by eliciting conformational effects that are similar but nonidentical to the gating conformations promoted by Ach. [3]

Test de fluorescence Ca²⁺

Des cellules épithéliales humaines SH-EP1 exprimant une variante du α7 nAChR (α7^*) sont cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) contenant des acides aminés non essentiels supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, de la L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 250 ng/mL de fungizone, 400 μg/mL d'hygromycine B et 800 μg/mL de généticine. α7^* est une variante du α7 nAChR humain, avec deux mutations ponctuelles dans le premier domaine transmembranaire (T230P et C241S) qui permettent une expression fonctionnelle élevée dans les cellules SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37 °C avec 6 % de CO₂. Les cellules sont trypsinisées et ensemencées dans des plaques à 96 puits avec des parois latérales sombres et des fonds clairs à une densité de 2 × 10⁴ cellules/puits 2 jours avant l'analyse. Les cellules sont chargées avec un mélange de Calcium Green-1 AM dans du diméthylsulfoxyde anhydre et 20 % de pluronic F-127. Ce réactif est ajouté directement au milieu de croissance de chaque puits pour atteindre une concentration finale de 2 μM de Calcium Green-1 AM. Les cellules sont ensuite incubées dans le colorant pendant 1 heure à 37 °C, puis lavées quatre fois avec la solution saline équilibrée d'Earle modifiée de Mark (MMEBSS) composée des éléments suivants (en mM) : 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucose, 20 Tris-HEPES et 120 N-méthyl-D-glucamine, pH 7,4. Après le quatrième cycle, les cellules sont laissées à incuber à 37 °C pendant au moins 10 minutes. Le volume final de MMEBSS dans chaque puits est de 100 μL et de l'atropine est ajoutée à tous les puits pour une concentration finale de 1 μM. Un lecteur de plaques d'imagerie fluorométrique (FLIPR ; Molecular Devices, Union City, CA) est configuré pour exciter le Calcium Green à 488 nm en utilisant 500 mW de puissance et en lisant l'émission de fluorescence >525 nm. Une exposition de 0,5 seconde est utilisée pour illuminer chaque puits. La fluorescence est détectée à l'aide d'un diaphragme réglé à 2,0 ou 1,2. Après 30 secondes d'enregistrement de base, les composés d'essai sont ajoutés à chaque puits d'une plaque à 96 puits dans 50 μL d'une solution stock 3 ×. Dans chaque expérience, quatre puits sont utilisés comme contrôles de véhicule (0,2 % DMSO).

Systemic administration of PNU-120596 (1 mg/kg) to rats improves the auditory gating deficit caused by amphetamine, a model proposed to reflect a circuit level disturbance associated with schizophrenia. [1] When administered prior to Carrageenan, 30 mg/kg of this compound significantly blunts mechanical hyperalgesia and weight bearing deficits for up to 4 hours. This chemical attenuates the carrageenan-induced increase in levels of TNF-α and IL-6 within the hindpaw oedema, diclofenac only attenuated IL-6 levels. Established mechanical hyperalgesia induced by Carrageenan or CFA is also partially reversed by this agent. [4]