NVP-BSK805 2HCl JAK inhibiteur

NVP-BSK805 inhibe puissamment JAK2, tout en présentant une sélectivité de plus de 20 fois envers JAK1, JAK3 et TYK2. NVP-BSK805 provoque une inhibition semi-maximale des enzymes JAK2^V617F pleine longueur et JAK2 de type sauvage à 0,5 nM. NVP-BSK805 bloque la croissance des cellules JAK2^V617F (Ba/F3) et induit l'apoptose avec un GI50 à des concentrations <100 nM. Comme la phosphorylation constitutive de STAT5 dépend de JAK2, NVP-BSK805 supprime puissamment la phosphorylation de STAT5 à des concentrations ">= 100 nM dans les lignées cellulaires mutantes JAK2^V617F, comme MB-02. L'incubation de cellules SET-2 avec 150 nM et 1 µM de NVP-BSK805, ce qui correspond à des concentrations produisant respectivement 75 % et 95 % d'inhibition de la croissance, pendant 24, 48 et 72 heures, conduit à une induction d'apoptose dépendante de la concentration et du temps. Ces résultats sont attestés par la détection de PARP clivé, une expression réduite de Bcl-xL et une forte augmentation du nombre de cellules avec moins de 2N d'ADN. [1] La mort cellulaire déclenchée par NVP-BSK805 nécessite l'activation des cascades de caspases et est surmontée par l'inhibition des caspases dans les cellules SET-2 et MB-02. NVP-BSK805 module la modification post-traductionnelle de Bim et les niveaux de Mcl-1 dans les cellules JAK2^V617F, les cellules SET-2 et MB-02. [2]

Essais enzymatiques

Le domaine kinase humain JAK2 (acides aminés 840-1132) est contenu dans le construit plasmidique pAcG2TtevJAK2. Les construits plasmidiques pour JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) et JAK1 (866-1154) sont conçus. La génération des baculovirus recombinants avec de l'ADN linéarisé BD BaculoGold^TM Bright, l'essai de plages et l'amplification du virus à partir de plages uniques sont réalisés selon le manuel (BD Biosciences Pharmingen). Les domaines de la kinase Janus sont exprimés dans des cellules Sf9 dans des fioles d'agitation de 400 mL avec 100 mL de milieu de culture ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) avec une solution de pénicilline/streptomycine pendant 48 h à 27 °C. Les cellules en culture en suspension sont infectées à une densité de 1 × 10⁶ et la multiplicité d'infection (MOI) pour chaque virus est optimisée pour le rendement en protéine soluble. Le domaine kinase de la JAK2 humaine et de JAK1, JAK3 et TYK2 est exprimé à un MOI de 1 et 0,5, respectivement. Le temps d'expression à 27 °C est de 48 heures pour JAK2 et de 48 heures ou 72 heures pour JAK1, JAK3 et TYK2. Quarante-huit ou soixante-douze heures après l'infection, les cellules d'une culture d'expression de 100 mL sont récoltées par centrifugation à 3000 x g pendant 5 minutes et lysées avec 12 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM orthovanadate de sodium, 1 % Triton X-100, 10 % glycérol, 1 x cocktail inhibiteur de protéase complet sans EDTA (Roche Diagnostics) et 12,5 U/mL Benzonase pendant 30 minutes à 4 °C, suivi d'une centrifugation à 14 000 × g pendant 45 minutes pour pélletter le matériel insoluble. Pour la purification par affinité par étiquette GST des protéines du domaine kinase, toutes les étapes sont effectuées à 4 °C. Les lysats clarifiés sont incubés avec 0,2 mL d'une suspension à 50 % de Glutathione Sepharose 4B lavée pendant 2 heures à 4 °C, suivi de 5 lavages avec 1 mL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT et 10 % glycérol. La protéine liée est éluée en 5 aliquotes, chacune commençant par une incubation de 10 minutes avec 0,25 mL de tampon d'élution (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glycérol, 10 mM L-glutathion réduit). Les éluats sont concentrés environ 5 fois avec des colonnes de centrifugation Amicon Ultra-4. Après addition de Brij35 à une concentration finale de 0,1 %, la protéine est congelée rapidement en petits aliquots et stockée à -80 °C. Dans ces conditions, les activités kinases sont stables pendant au moins 6 mois. Les enzymes du domaine kinase JAK sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans un milieu contenant 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM de substrat peptidique synthétique EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 et 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentration d'ATP est inférieure au Km pour toutes les protéines. Les courbes sont ajustées par régression non linéaire à l'aide de l'équation logistique et de la fonction d'ajustement global de XLfit® (modèle 205). L'expression et la caractérisation de JAK2 de type sauvage et mutant V617F pleine longueur ainsi que les conditions d'essai kinase ont été décrites ailleurs. La sélectivité kinase de NVP-BSK805 est évaluée dans un panel interne de kinases : Dans les essais Caliper, les réactions kinases sont effectuées avec des substrats peptidiques qui migrent à des vitesses différentes dans un champ électrique lorsqu'ils sont phosphorylés. Les peptides portent un marqueur fluorescent afin de permettre la détection et la quantification des peptides dans un système capillaire. Les intensités de fluorescence des peptides sont quantifiées à l'aide de l'instrument LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). L'activité kinase est mesurée en quantifiant la quantité d'ATP restant en solution après une réaction kinase. Dans les essais kinases LanthaScreen™ TR-FRET, le terbium est utilisé comme chélate de lanthanide combiné à un anticorps dirigé contre le substrat phosphorylé.

La biodisponibilité orale de NVP-BSK805 chez les souris est estimée à 45 %, tandis qu'elle est de 50 % chez les rats. L'administration orale de NVP-BSK805 à 150 mg/kg supprime la phosphorylation de STAT5, la splénomégalie et la propagation des cellules leucémiques dans un modèle murin piloté par des cellules Ba/F3 JAK2^V617F. NVP-BSK805 supprime la phosphorylation de STAT5 induite par rhEpo ainsi que la polycythémie et la splénomégalie médiatisées par rhEpo chez les souris BALB/c à des doses orales de 25, 50 et 100 mg/kg. [1]