CP-466722 ATM/ATR inhibiteur

In vitro, le CP-466722 est identifié comme un inhibiteur potentiel pour diminuer l'activité de la kinase ATM purifiée à phosphoryler le substrat GST-p53(1–101). De plus, ce composé montre également des activités inhibitrices contre les kinases Abl et Src. [1] Dans les cellules HeLa, ce composé, à des doses de 6 μM, entraîne l'inhibition de la phosphorylation dépendante de l'ATM en inhibant réversiblement l'activité de la kinase ATM induite par les radiations ionisantes (IR). En outre, l'induction de p53 dépendante de l'ATM est également inhibée par cette substance chimique dans les cellules de cancer du sein humain MCF-7 et les fibroblastes humains diploïdes primaires et immortalisés. [1] En réponse à l'IR, ce composé a augmenté la proportion de cellules avec un contenu en ADN G2/M et a réduit la proportion de cellules avec un contenu en ADN en phase G1 dans les cellules HeLa. [1] Une exposition transitoire à cette substance chimique pendant 4 heures sensibilise les cellules HeLa aux IR sans affecter le plaquage cellulaire ni la viabilité cellulaire. [1]

Essais kinases in vitro [1]

Pour cribler les inhibiteurs de petites molécules de l'activité kinase de l'ATM, un essai kinase in vitro est adapté et un essai ELISA est développé, qui mesure l'état de phosphorylation de la cible p53 en aval de l'ATM. La GST-p53(1-101) recombinante et l'ATM et l'ATR pleine longueur marquées par Flag sont purifiées pour être utilisées dans les essais ELISA et les essais kinases in vitro. En bref, les plaques Nunc 96 puits Maxisorp sont revêtues pendant une nuit (4 °C) avec 2 μg de GST-p53(1-101) recombinante purifiée dans du PBS. Toutes les incubations ultérieures sont effectuées à température ambiante. Les plaques sont lavées (0,05 % v/v-Tween/PBS) avant l'ajout de kinase ATM recombinante purifiée de pleine longueur (30 ng–60 ng) dans un volume final de 80 μL de tampon de réaction (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT et 1 μM ATP) en présence ou en l'absence de CP-466722. Ce composé (10 μM) est ajouté aux plaques en double et l'essai kinase est incubé (90 minutes). Les plaques sont lavées (0,05 % v/v-Tween/PBS), bloquées (1 heure, 1 % p/v-BSA/PBS) et rincées avant l'ajout de l'anticorps anti-Phospho(Ser15)-p53 (1:1000/PBS) aux plaques et incubation (1 heure). Pour réduire la liaison non spécifique, les plaques sont lavées (0,05 % v/v-Tween/PBS) avant l'incubation (1 heure) avec l'anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin conjugué à la HRP (1:5000/PBS). L'anticorps secondaire lié à la protéine GST-p53(1–101) phosphorylée est détecté avec le réactif de substrat TMB. Les plaques sont développées (15 minutes–30 minutes) et la réaction est arrêtée (concentration finale de 1 M H₂SO₄) avant que l'absorbance ne soit déterminée (λ450nm). Ce composé, qui inhibe l'activité de la kinase ATM dans les essais ELISA, est caractérisé en ce qui concerne l'inhibition des kinases ATM/ATR à l'aide d'essais kinases in vitro. Le Western blot utilisant l'anticorps anti-Phospho(Ser15)-p53 est utilisé comme lecture de l'inhibition de l'ATM/ATR. Une analyse étendue de cette substance chimique (10 μM) contre un panel de kinases disponible commercialement est réalisée par Upstate.