LDN-57444 DUB inhibiteur

Le traitement avec 50 μM de LDN-57444 pendant 24 h entraîne une inhibition de 70 % de l'activité du protéasome. Ce composé provoque une diminution significative et dose-dépendante de la viabilité cellulaire à des concentrations supérieures à 25 μM, et la viabilité cellulaire est réduite à 61,81 % à 50 μM. Il est capable de provoquer la mort cellulaire par la voie de l'apoptose en diminuant l'activité du système ubiquitine protéasome et en augmentant les niveaux de protéines fortement ubiquitinylées, ce qui peut activer la réponse aux protéines mal repliées. L'apoptose induite par cette substance chimique peut être déclenchée par l'activation du stress du réticulum endoplasmique (ERS). [4]

Criblage HTS

Pour démarrer un dosage, 0,5 μL de composé d'essai à 5 mg/mL (environ 50 μM de concentration de réaction finale) ou de contrôle DMSO sont aliquotes dans chaque puits. L'enzyme et le substrat sont préparés dans le tampon de réaction UCH (50 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT et 0,5 mg/mL d'ovalbumine). 25 μL de 0,6 nM UCH-L1 sont ensuite ajoutés à chaque puits, à l'exception des puits de contrôle du substrat, suivis d'une agitation de la plaque pendant 45 à 60 s sur un agitateur automatique. Le mélange enzyme/composé est incubé à température ambiante pendant 30 min avant l'ajout de 25 μL de 200 nM Ub-AMC pour initier la réaction enzymatique. Le mélange réactionnel (300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitin-AMC avec 2,5 μg de composé d'essai) est incubé à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires avant d'arrêter la réaction par l'ajout de 10 μL d'acide acétique 500 mM par puits. L'intensité d'émission de fluorescence est mesurée sur un LJL Analyst à l'aide d'un ensemble de filtres à la coumarine (ex = 365 nm, em = 450 nm) et est soustraite de la fluorescence intrinsèque du composé pour révéler l'activité enzymatique. Un contrôle DMSO (0,5 μL de DMSO, 25 μL d'UCH-L1, 25 μL d'ubiquitine-AMC, 10 μL d'acide acétique), un contrôle enzymatique (25 μL d'UCH-L1, 25 μL de tampon, 10 μL d'acide acétique), un contrôle de substrat (25 μL de tampon, 25 μL d'ubiquitine-AMC, 10 μL d'acide acétique) et un contrôle inhibiteur (0,5 μL d'aldéhyde d'ubiquitine [stock 100 nM], 25 μL d'UCH-L1, 25 μL d'ubiquitine-AMC, 10 μL d'acide acétique) sont également réalisés dans chaque plaque d'essai pour assurer la qualité et la reproductibilité. Les inhibiteurs potentiels d'UCH-L1 sont sélectionnés si les composés ont démontré une inhibition supérieure à 60 % par rapport aux contrôles. Les réactions enzymatiques d'UCH-L1 sont répétées manuellement deux fois en utilisant le même protocole pour confirmer les résultats des composés « hit » du criblage robotisé primaire.

LDN-57444 provoque des altérations dramatiques de la distribution des protéines synaptiques et de la morphologie des épines in vivo. Le traitement avec ce composé entraîne également une chute rapide de l'activité de l'Uch-L1, mais l'inhibition du protéasome n'a aucun effet sur les niveaux de cAMP sur une période de plusieurs heures. [3]