CP-724714 HER2 Inhibiteur

CP-724,714 is marked selectively against EGFR with IC50 of 6.4 μM. CP-724,714 is >1,000-fold less potent for IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminal kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, cyclin-dependent kinase (CDK)-2, and CDK-5. CP-724,714 potently reduces the EGF-induced autophosphorylation of the chimera containing the erbB2 kinase domain with IC50 of 32 nM, but is markedly less potent against EGFR in transfected NIH3T3 cells. CP-724,714 sensitively inhibits the proliferation of erbB2-amplified cells including BT-474 and SKBR3, with IC50 of 0.25 and 0.95 μM. CP-724,714 induces the accumulation of cells in G1 phase and a marked reduction in S-phase in BT-474 cells at 1 μM. [1] CP-724,714 likely exerts its hepatotoxicity via both hepatocellular injury and hepatobiliary cholestatic mechanisms. CP-724,714 displays inhibition of cholyl-lysyl and taurocholate (TC) efflux into canaliculi in cryopreserved and fresh cultured human hepatocytes, respectively. CP-724,714 inhibits TC transport in membrane vesicles expressing human bile salt export pump with IC50 of 16 μM and inhibits the major efflux transporter in bile canaliculi, MDR1, with IC50 of ~28 μM. [2]

Essais de kinase

Les domaines intracellulaires recombinants d'erbB2 (résidus d'acides aminés 675-1255) et d'EGFR (résidus d'acides aminés 668-1211) sont exprimés dans des cellules Sf9 infectées par le baculovirus sous forme de protéines de fusion S-transférase. Les protéines sont purifiées par chromatographie d'affinité sur des billes de Sépharose pour être utilisées dans l'essai. Des plaques Nunc MaxiSorp de 96 puits sont revêtues par incubation pendant une nuit à 37 °C avec 100 μL/puits de 0,25 mg/mL de poly(Glu:Tyr, 4:1), PGT dans du PBS. L'excès de PGT est retiré par aspiration et la plaque est lavée 3 fois avec du tampon de lavage (0,1 % de Tween 20 dans du PBS). La réaction de la kinase est effectuée dans 50 μL de 50 mM HEPES (pH 7,4) contenant 125 mM de chlorure de sodium, 0,1 mM d'orthovanadate de sodium, 1 mM d'ATP et ~15 ng de protéine recombinante. Des inhibiteurs dans du DMSO sont ajoutés ; la concentration finale de DMSO est de 2,5 %. La phosphorylation est initiée par l'ajout d'ATP et se poursuit pendant 6 min à température ambiante, avec une agitation constante. La réaction de la kinase est terminée par aspiration du mélange réactionnel et lavage quatre fois avec du tampon de lavage. Le PGT phosphorylé est mesuré après une incubation de 25 min avec 50 μL/puits d'anticorps antiphosphotyrosine PY54 conjugué à la HRP, dilué à 0,2 μg/mL dans du tampon de blocage (3 % de BSA, 0,05 % de Tween 20 dans du PBS). L'anticorps est retiré par aspiration et la plaque est lavée quatre fois avec du tampon de lavage. Le signal colorimétrique est développé par l'ajout de 50 μL/puits de substrat de peroxydase tétraméthylbenzidine en micropuits et arrêté par l'ajout de 50 μL/puits d'acide sulfurique 0,09 M. Le produit de phosphotyrosine formé est estimé par la mesure de l'absorbance à 450 nm. Le signal pour les contrôles est typiquement A0,6–1,2, avec pratiquement aucun arrière-plan dans les puits sans ATP, protéine kinase ou PGT, et est proportionnel au temps d'incubation pendant 6 min.

CP-724,714 (25 mg/kg) is rapidly absorbed after p.o. administration and causes reduction of tumor erbB2 receptor phosphorylation after dosing in FRE-erbB2 or BT-474 xenografts. CP-724,714 induces apoptosis in FRE-erbB2 xenograft–bearing (s.c.) mice and shows 50% tumor growth inhibition at 50 mg/kg, without weight loss or mortality. CP-724,714 also has great antitumor activity in MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts. Furthermore, CP-724,714 (30 or 100 mg/kg) reduces the extracellular signal–regulated kinase and Akt phosphorylation in BT-474 xenografts. [1]