AZD2858 GSK-3 inhibiteur

AZD2858 est un inhibiteur sélectif de la GSK-3 avec une IC50 de 68 nM, qui inhibe la phosphorylation de tau au site S396 et active la voie de signalisation Wnt. Le traitement par ce composé (1 μM, 12 h) sur des cellules ostéoblastiques humaines isolées primaires entraîne une augmentation de 3 fois des niveaux de β-caténine. [1] Il provoque une stabilisation de la β-caténine dans les cellules souches mésenchymateuses humaines et de rat, stimule l'engagement des hADSC vers les ostéoblastes et la minéralisation ostéogénique in vitro. [2]

Test de phosphorylation de Tau

Des cellules NIH-3T3 exprimant la protéine Tau à 4 répétitions sont utilisées pour évaluer l'activité fonctionnelle de l'AZD2858 in vitro. Les cellules sont cultivées dans un milieu DMEM, 2 mM de L-glutamine et 10 % de HiFCS, et ensemencées à une concentration de 6×10⁵ cellules/puits dans des plaques à 6 puits. Dans chaque expérience, ce composé est dosé en triplicata à des concentrations de 1, 10, 100, 500, 1000, 2000 et 10 000 nM. Les cellules sont traitées pendant 4 h avant la lyse cellulaire à l'aide de 100 μL de tampon de lyse froid (0,5 % NP-40, 10 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA). Une suspension est préparée avec l'ajout d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase : 50 mM NaF, 0,2 mM NaVO4 et un cocktail d'inhibiteurs de protéase. La solution est ensuite congelée instantanément à – 80 °C pendant au moins 1 h, avant d'être décongelée sur glace et le lysat clarifié par centrifugation, suivi d'un Western blot selon les protocoles standard. Après blocage, les membranes sont exposées à l'anticorps primaire, Phospho-Ser396-tau (1:1000) pendant une nuit, lavées et incubées avec l'anticorps secondaire (anticorps anti-lapin de l'âne, 1:5000), suivi d'un lavage final. Pour le reprobing, l'anticorps primaire Tau5 (1:200) et l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (anticorps anti-souris de la brebis, 1:10000) sont utilisés. Tous les immunoblots sont développés à l'aide de réactifs de détection Western blot ECL, de films radiographiques Kodak, quantifiés par analyse densitométrique, et le rapport de la protéine S396 tau sur la protéine tau totale (tau5) est calculé.

Chez les rats, le traitement oral par AZD2858 provoque une augmentation dose-dépendante de la masse osseuse trabéculaire par rapport au groupe témoin après un traitement de deux semaines, avec un effet maximal à une dose de 20 mg/kg une fois par jour (BMC totale : 172 % du témoin). Un effet faible mais significatif est également observé au niveau des sites corticaux (BMC totale : 111 % du témoin). [1] Ce composé (30 μmol/kg) administré quotidiennement à des rats pendant 3 semaines maximum montre une augmentation de la densité minérale (de 28 % à 2 semaines et 38 % à 3 semaines) et du contenu minéral (de 81 % à 2 semaines et 93 % à 3 semaines) dans les cals. Ce traitement permet une guérison plus rapide des fractures, avec un cal osseux sans composant endochondral évident. [3] Il produit des changements dépendants du temps dans les biomarqueurs sériques du remodelage osseux et augmente la masse osseuse sur une exposition de 28 jours chez les rats. Après 7 jours, ce composé augmente le biomarqueur de formation osseuse P1NP et réduit le biomarqueur de résorption TRAcP-5b, indiquant une augmentation de l'anabolisme osseux et une réduction de la résorption chez les rats. [2]