AMG319 PI3K inhibiteur

AMG319 inhibe la prolifération des lymphocytes B induite par anti-IgM/CD40L avec une IC50 de 8,6 nM et réduit le niveau de pAkt avec une IC50 de 1,5 nM. Ce composé inhibe également l'expression de CD-69 induite par anti-IgD dans HWB. [1]

Tests enzymatiques PI3K

Un essai Alphascreen PI3K est utilisé pour mesurer l'activité d'un panel de quatre phosphoinositide 3-kinases : PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ et PI3Kδ. Le tampon de réaction enzymatique est préparé en utilisant de l'eau stérile et 50 mM Tris-HCl, pH 7, 14 mM MgCl₂, 2 mM cholate de sodium et 100 mM NaCl. 2 mM de DTT est ajouté frais le jour de l'expérience. Le tampon Alphascreen est préparé en utilisant de l'eau stérile et 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,10 % Tween 20 et 30 mM EDTA. Ensuite, 1 mM de DTT est ajouté frais le jour de l'expérience. Les plaques sources de composés utilisées pour cet essai sont des plaques de polypropylène transparentes Greiner à 384 puits contenant des composés de test à 5 mM et dilués 1:2 sur 22 concentrations. Les colonnes 23 et 24 contenaient uniquement du DMSO, car ces puits comprenaient respectivement les contrôles positifs et négatifs. Les plaques sources sont répliquées en transférant 0,5 μL par puits dans des Optiplates à 384 puits. Chaque isoforme de PI3K est diluée dans un tampon de réaction enzymatique pour obtenir des stocks de travail 2×. PI3Kα est dilué à 1,6 nM, PI3Kβ est dilué à 0,8 nM, PI3Kγ est dilué à 15 nM et PI3Kδ est dilué à 1,6 nM. PI(4,5)P2 est dilué à 10 μM et l'ATP a été dilué à 20 μM. Ce stock 2× est utilisé dans les essais pour PI3Kα et PI3Kβ. Pour l'essai de PI3Kγ et PI3Kδ, PI(4,5)P2 est dilué à 10 μM et l'ATP a été dilué à 8 μM pour préparer un stock de travail 2× similaire. Les solutions de réaction Alphascreen sont fabriquées à l'aide de billes du kit Alphascreen anti-GST. Deux stocks de travail 4× des réactifs Alphascreen sont préparés dans le tampon de réaction Alphascreen. Dans un stock, le IP4 biotinylé est dilué à 40 nM et les billes donneuses de streptavidine sont diluées à 80 μg/mL. Dans le second stock, la protéine de liaison à PIP3 est diluée à 40 nM et les billes accepteuses anti-GST sont diluées à 80 μg/mL. En tant que contrôle négatif, un inhibiteur de référence à une concentration ≫Ki (40 μM) est inclus dans la colonne 24 comme contrôle négatif (100 % d'inhibition). À l'aide d'un Multidrop à 384 puits, 10 μL/puits de stock enzymatique 2× sont ajoutés aux colonnes 1 à 24 des plaques d'essai pour chaque isoforme. Une quantité de 10 μL/puits du stock 2× de substrat approprié (contenant 20 μM d'ATP pour les essais PI3Kα et -β et contenant 8 μM d'ATP pour les essais PI3Kγ et -δ) est ensuite ajoutée aux colonnes 1 à 24 de toutes les plaques. Les plaques sont ensuite incubées à température ambiante pendant 20 min. Dans l'obscurité, 10 μL/puits de la solution de billes donneuses sont ajoutés aux colonnes 1 à 24 des plaques pour éteindre la réaction enzymatique. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant 30 min. Toujours dans l'obscurité, 10 μL/puits de la solution de billes accepteuses sont ajoutés aux colonnes 1 à 24 des plaques. Les plaques sont ensuite incubées dans l'obscurité pendant 1,5 h. Les plaques sont lues sur un lecteur de plaques multimode Envision à l'aide d'un filtre d'excitation de 680 nm et d'un filtre d'émission de 520 à 620 nm.

Chez les rats Lewis femelles, AMG319 (3 mg/kg, p.o.) inhibe la réponse inflammatoire induite par le KLH de 88 %. Chez les souris transgéniques (IgMm), ce composé (, p.o.) inhibe le pAKT in vivo avec une IC50 de 1,9 nM. [1]