AT7519 HCl CDK inhibiteur

AT7519 est un inhibiteur de CDK compétitif de l'ATP avec une valeur K_i de 38 nM pour CDK1. AT7519 est inactif contre toutes les kinases non-CDK à l'exception de GSK3β (IC50 = 89 nM). AT7519 montre une activité antiproliférative puissante dans une variété de lignées cellulaires tumorales humaines avec des valeurs IC50 allant de 40 nM pour MCF-7 à 940 nM pour SW620, ce qui est cohérent avec l'inhibition de CDK1 et CDK2. [1] AT7519 induit une cytotoxicité dose-dépendante dans les lignées cellulaires de myélome multiple (MM) avec des valeurs IC50 allant de 0,5 à 2 μM à 48 heures, les lignées cellulaires les plus sensibles étant MM.1S (0,5 μM) et U266 (0,5 μM) et la plus résistante MM.1R (>2 μM). Il n'induit pas de cytotoxicité dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMNC). AT7519 surmonte partiellement l'avantage prolifératif conféré par l'IL6 et l'IGF-1 ainsi que l'effet protecteur des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSCs). AT7519 induit une déphosphorylation rapide de l'ARN pol II CTD aux sites sérine 2 et sérine 5, et conduit à l'inhibition de la transcription, contribuant partiellement à la cytotoxicité des cellules MM induite par AT7519. AT7519 induit l'activation de GSK-3β par la régulation négative de la phosphorylation de GSK-3β, ce qui contribue également à l'apoptose induite par AT7519 indépendamment de l'inhibition de la transcription. [2]

Essais kinases in vitro

Les essais kinases pour CDK1, CDK2 et GSK3-β sont tous réalisés sous un format de liaison sur filtre radiométrique. Les essais pour CDK5 sont au format DELFIA et pour les CDKs 4 et 6 au format ELISA. Pour les CDKs 1 et 2, la CDK pertinente et 0,12 μg/mL d'Histone H1 sont incubés dans 20 mM MOPS, pH 7,2, 25 mM β-glycérophosphate, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM orthovanadate de sodium, 1 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 45 μM ATP (0,78 Ci/mmol) et différentes concentrations d'AT7519 pendant respectivement 2 ou 4 heures. Pour GSK3-β, l'enzyme pertinente et 5 μM de peptide de glycogène synthase 2 ainsi que 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1 mg/mL BSA, 0,001% Brij-35, 0,5% glycérol, 0,2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,01% β-mercaptoéthanol, 15 μM ATP (2,31 Ci/mmol) et différentes concentrations d'AT7519 sont incubés pendant 3 heures. Les réactions d'essai sont arrêtées par addition d'un excès d'acide orthophosphorique et filtrées à l'aide de plaques filtrantes Millipore MAPH. Les plaques sont ensuite lavées, un scintillant est ajouté et la radioactivité est mesurée par comptage de scintillation sur un Packard TopCount. Pour CDK5, CDK5/p35 et 1 μM d'un peptide Histone H1 biotinylé (Biotine-PKTPKKAKKL) sont incubés dans 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM MgCl₂, 0,025% Brij-35, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 15 μM ATP et différentes concentrations d'AT7519 pendant 30 minutes. Les réactions d'essai sont arrêtées à l'aide d'EDTA, transférées sur des plaques revêtues de Neutravidine et le peptide phosphorylé est quantifié au moyen d'un anticorps polyclonal de substrat phospho-cdk1 de lapin et d'un anticorps secondaire anti-lapin IgG marqué à l'europium DELFIA utilisant une fluorescence résolue dans le temps à λ_ex=335nm, λ_em=620nm. Pour les essais CDK 4 et 6, les plaques sont revêtues de GST-pRb769-921 et bloquées avec Superblock. CDK4 ou 6 est incubé avec 15 mM MgCl₂, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,02% Triton X-100, 2,5% DMSO et différentes concentrations d'AT7519 ; la réaction est initiée par addition d'ATP. Après 30 minutes, les réactions sont arrêtées par addition de 0,5 M EDTA pH 8,0. Les plaques sont ensuite lavées et incubées pendant une heure avec l'anticorps primaire (anti-p-Rb Sérine 780) dilué dans Superblock, suivi de l'anticorps secondaire (anti-lapin lié à la phosphatase alcaline) pendant une heure supplémentaire. Les plaques sont développées à l'aide du système Attophos et la fluorescence est lue sur un lecteur de plaques Spectramax Gemini à une excitation de 450 nm et une émission de 580 nm. Dans tous les cas, les valeurs IC50 sont calculées à partir de courbes répétées, à l'aide du logiciel GraphPad Prism.

Une administration biquotidienne de AT7519 (9,1 mg/kg) provoque la régression tumorale des tumeurs s.c. à un stade précoce et avancé dans les modèles de xénogreffe de cancer du côlon HCT116 et HT29. [1] Le traitement par AT7519 (15 mg/kg) inhibe la croissance tumorale et prolonge la survie globale médiane des souris dans le modèle murin de xénogreffe de myélome multiple humain en association avec une activation accrue de la caspase 3. [2]