SU9516 CDK inhibiteur

SU9516 diminue la phosphorylation spécifique de cdk2 de la protéine pRB du rétinoblastome, augmente l'activation de la caspase-3 et modifie le Cell Cycle dans les cellules RKO et SW480. Ce composé inhibe également la prolifération cellulaire et induit l'apoptose cellulaire dans les deux lignées cellulaires. [1] Il tue les cellules leucémiques par inhibition de la phosphorylation de l'extrémité C-terminale de l'ARN polymérase II, des dommages oxydatifs et de la régulation transcriptionnelle négative de Mcl-1. [2] Dans les cellules Jurkat de leucémie à cellules T humaines, ce produit chimique améliore significativement la sensibilité au méthotrexate. [3] De plus, il supprime également la localisation centrosomale d'Aurora-A et l'amplification du centrosome qui en résulte. [4]

Essai de kinase CDK

Les essais de kinase sont effectués dans des plaques de polypropylène à 96 puits. Chaque réaction contenait 2 μg d'histone H1 à une concentration finale de 10 μM [γ-³³P]ATP (0,2 μCi/puits ; environ deux fois le Km déterminé expérimentalement), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01 % de Triton X-100 et 10 % de glycérol dans un volume de 40 μL. La réaction est initiée par l'ajout de 20 μL d'enzyme (6 ng cdk2/puits, résultant en une concentration finale de 1,6 nM), qui est préalablement diluée de 1:50 à 1:200 dans le même tampon, et laissée se dérouler pendant 1 h à température ambiante. La réaction est arrêtée par l'ajout de 0,01 mL d'acide phosphorique à 10 %, et 25 μL du mélange réactionnel sont transférés sur du papier filtre de phosphocellulose P30. Le tapis filtrant est lavé trois fois avec 1,0 % d'acide phosphorique, séché à l'air, puis compté pour la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide. L'essai de kinase cdk4 pour la cycline D1-cdk4 est réalisé dans un format de microplaques à 96 puits en polypropylène mesurant l'incorporation de phosphate radioactif dans le GST-Rb. La cycline D1-cdk4 purifiée est incubée avec 1 μg de GST-Rb dans 20 mM HEPES (pH 7,5) en présence de 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01 % de Triton X-100 et 10 % de glycérol. La concentration finale de cdk4 est de 10 ng/puits, soit 1,6 nM. La réaction de kinase est initiée par l'ajout d'ATP à une concentration finale de 10 μM ATP (deux fois le Km déterminé expérimentalement) et de [γ-³³P]ATP (1,0 μCi par puits) dans un volume de 60 μL et laissée se dérouler à température ambiante pendant 1 h. La réaction est arrêtée par l'ajout de 0,01 ml d'acide phosphorique à 10 %, et 25 μL du mélange réactionnel sont transférés sur du papier filtre de phosphocellulose P30. Le tapis filtrant est traité comme pour les essais Cdk1/Cdk2.